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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的癌症之一,HCC的发病率逐年上升,其治疗方法缺乏。本课题通过调控长链非编码RNA NKILA表达,探讨黄芩素对肝癌细胞株增殖、凋亡、迁移的影响;初探NF-κB信号通路在LncRNA NKILA对黄芩素抗肝癌细胞中的作用及机制。为黄芩素抗肝癌治疗作用提供新的靶点,为中医中药抗肿瘤作用提供新的思路。方法:(1)肝组织中NKILA的表达水平检测:提取35对肝癌组织及癌旁组织的RNA,qRT-PCR法检测NKILA的表达水平;(2)建立上调、下调NKILA稳定表达的肝癌细胞株:用脂质体3000分别将NKILA质粒、Vector质粒(空白质粒)及NKILA shRNA质粒(shNKILA,特异性干扰质粒)、Vector shRNA质粒(shVector,非特异性干扰质粒)转染到SMMC-7721细胞中,通过G418筛选建立稳定表达的肝癌细胞株,qRT-PCR法检测NKILA表达情况。(3)LncRNA NKILA对黄芩素抗SMMC-7721细胞活力、凋亡、迁移的影响:建立NKILA上调细胞实验组、NKILA下调细胞实验组。上调细胞实验组设置空白对照组1(空白质粒)、黄芩素对照组1(空白质粒+黄芩素)和NKILA上调组(NKILA质粒+黄芩素);下调细胞实验组设置空白对照组2(非特异性干扰质粒)、黄芩素对照组2(非特异性干扰质粒+黄芩素)、NKILA下调组(NKILA特异性干扰质粒+黄芩素)。黄芩素处理上、下调细胞实验组浓度分别为50、100μmol/L,作用时间48h。CellTiter-Glo?发光法检测细胞活力、TUNEL检测细胞凋亡、Transwell检测细胞迁移;(4)NF-κB信号通路活化指标IκBα磷酸化、p65核移位检测:western blot分别检测空白对照组1、黄芩素对照组1和NKILA上调组及空白对照组2、黄芩素对照组2和NKILA下调组各组细胞p-IκBα/IκBα及P65蛋白表达情况。结果:(1)肝癌组织与癌旁组织相比,NKILA表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)qRT-PCR检测转染Vector质粒、NKILA质粒及shVector质粒、shNKILA质粒后的SMMC-7721细胞NKILA相对表达量分别为1.00±0.04、4.97±0.20及1.00±0.06、0.28±0.03,差异都具有统计学意义(P<0.05);(3)CellTiter-Glo?发光法检测细胞活力结果:以发光信号值表示活细胞数量,对照组细胞活力设为100%。空白对照组1、黄芩素对照组1、NKILA上调组三组细胞活力分别为100.00±7.17、70.34±2.34、25.31±2.36,结果显示黄芩素对照组1较空白对照组1细胞活力下降(P<0.05),并且NKILA上调组细胞活力显著下降,与黄芩素对照组1相比,差异具有统计学意义(P<0.05);空白对照组2、黄芩素对照组2、NKILA下调组三组细胞活力分别为100.00±4.05、67.67±2.60、96.67±2.91,结果显示NKILA下调组细胞活力较黄芩素对照组2升高,差异具有统计学意义(P<0.05),并且NKILA下调组细胞活力低于空白对照组2细胞活力,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)TUNEL检测细胞凋亡结果:空白对照组1、黄芩素对照组1、NKILA上调组三组细胞凋亡率分别为2.75%±0.47%、12.31%±1.65%、42.00%±3.33%,结果显示黄芩素对照组1较空白对照组1细胞凋亡率升高(P<0.05),并且NKILA上调组细胞凋亡率显著升高,与黄芩素对照组1相比,差异具有统计学意义(P<0.05);空白对照组2、黄芩素对照组2、NKILA下调组三组细胞凋亡率分别为2.95%±0.45%、34.39%±2.90%、9.70%±1.30%,结果显示NKILA下调组较黄芩素对照组2细胞凋亡率降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而NKILA下调组凋亡率高于空白对照组2凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)Transwell分析检测迁移结果:空白对照组1、黄芩素对照组1、NKILA上调组三组细胞迁移数分别为94.00±5.51、45.67±4.06、11.00±1.00,结果显示黄芩素对照组1较空白对照组1细胞迁移数减少(P<0.05),并且NKILA上调组细胞迁移显著减少,与黄芩素对照组1相比,差异具有统计学意义(P<0.05);空白对照组2、黄芩素对照组2、NKILA下调组三组细胞迁移数分别为84.00±4.93、15.00±2.31、65.00±5.20,结果显示NKILA下调组较黄芩素对照组2细胞迁移数增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而NKILA下调组细胞迁移数低于空白对照组2,差异无统计学意义(P>0.05)。(6)western blot检测p-IκBα/IκBα及P65蛋白表达结果:以灰度值表示蛋白量,对照组灰度值设为1。空白对照组1、黄芩素对照组1、NKILA上调组三组p-IκBα相对表达量分别为1.00±0.06、0.53±0.04、0.13±0.03,而IκBα相对表达量分别为1.00±0.05、1.54±0.05、2.07±0.05,结果显示黄芩素对照组1较空白对照组1的p-IκBα表达降低,IκBα表达升高,差异都具有统计学意义(P<0.05)。NKILA上调组较黄芩素对照组1的p-IκBα表达降低,IκBα表达升高,差异也都具有统计学意义(P<0.05)。也就是说,黄芩素对IκBα磷酸化具有抑制的作用,且NKILA上调后这种抑制作用更加明显。空白对照组2、黄芩素对照组2、NKILA下调组三组p-IκBα相对表达量分别为1.00±0.05、0.54±0.04、0.93±0.04,而IκBα的相对表达量分别为1.00±0.06、1.47±0.03、1.12±0.04,结果显示NKILA下调组较黄芩素对照组2的p-IκBα表达升高,IκBα表达下降,差异都具有统计学意义(P<0.05)。NKILA下调组较空白对照组2的p-IκBα表达低,IκBα表达高,但差异都不具有统计学意义(P>0.05)。也就是说,黄芩素对IκBα磷酸化具有抑制的作用,而NKILA下调后这种抑制作用减弱。同时,检测P65核移位情况:空白对照组1、黄芩素对照组1、NKILA上调组三组细胞核的p65相对表达量分别为1.00±0.05、0.52±0.03、0.25±0.01,而细胞质的p65相对表达量分别为1.00±0.05、1.84±0.09、2.78±0.12,结果显示黄芩素对照组1较空白对照组1的细胞核p65表达下降,细胞质p65表达升高,差异都具有统计学意义(P<0.05);NKILA上调组较黄芩素组1的细胞核p65表达升高,细胞质p65下降,差异都具有统计学意义(P<0.05)。也就是说,黄芩素抑制了p65核移位,且NKILA上调后这种抑制作用更加明显。空白对照组2、黄芩素对照组2、NKILA下调组三组细胞核的p65相对表达量分别为1.00±0.07、0.45±0.03、0.78±0.06,而细胞质的p65相对表达量分别为1.00±0.05、1.77±0.09、1.34±0.04,结果显示NKILA下调组较对照黄芩素组2的细胞核p65表达升高,细胞质p65表达下降,差异都具有统计学意义(P<0.05);NKILA下调组较空白对照组2的细胞核p65低,细胞质p65表达高,但差异都不具有统计学意义(P>0.05)。也就是说,黄芩素抑制了p65核移位,而NKILA下调后这种抑制作用减弱。结论:1、黄芩素具有抗肝癌细胞SMMC-7721的作用;2、NKILA既能增强黄芩素对肝癌细胞SMMC-7721增殖和迁移的抑制作用,又能增强其促凋亡作用;3、NKILA增强了黄芩素对肝癌细胞SMMC-7721 IκBα磷酸化、p65核移位抑制,并可通过NF-κB信号通路增强黄芩素抗肝癌细胞SMMC-7721的作用。