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马兜铃酸（aristolochic acids,AAs）及其衍生物是许多传统药物的组成部分,已经有几千年的应用历史。AAs可致肾毒性和泌尿系肿瘤早已获得广泛共识,国际癌症研究中心（IARC）也将AAs列为第Ⅰ类致癌物。AAs诱导泌尿系肿瘤的机制尚不完全清楚,目前研究发现AAs经代谢形成马兜铃内酰胺氮离子可以与DNA结合形成DNA加合物（AAs-DNA加合物）,由于AAs-DNA加合物难以代谢,导致在体内长期蓄积,从而诱发DNA发生AAs特征指纹突变,即A:T→T:A颠换突变。AAs主要分为马兜铃酸Ⅰ（Aristolochic acid I,AA-I）和马兜铃酸Ⅱ（Aristolochic acidⅡ,AA-Ⅱ）,而已有研究表明AA-Ⅰ和AA-Ⅱ都具有遗传毒性,而AA-Ⅰ是肾毒性的主要原因。2015版和2020版药典只对AA-Ⅰ给出了限量标准。马兜铃内酰胺I（aristololactam I,AL-I）是AA-I的主要代谢产物,同时也在马兜铃科、番荔枝科、北豆科、胡椒科、念珠科和紫苏科等植物中独立存在。已有体外和体内动物实验初步确认相同浓度或相同剂量的AL-I比AA-I对肾脏的细胞毒性更强,肾脏损伤更严重。然而AL-I是否具有遗传毒性和致癌性报道非常少。前期本实验室研究发现AL-I有体外致染色体断裂性,且合作实验室发现AL-I可以在小鼠体内形成DNA加合物。基于以上发现,本研究在传统遗传毒性标准实验组合的基础上,采用体外PIG-A基因突变方法评价AL-I的致突变性。此外,在26周转基因小鼠致癌实验中伴随致突变、致断裂和致DNA损伤的多个遗传终点研究,综合探索AL-I的潜在致癌性及其机制,为含AL-I的植物药使用和风险监管提供一定的理论依据。本课题分为两个部分:第一部分:采用我们前期建立的体外TK6人淋巴母细胞的PIG-A突变实验方法,评价了 AA-I和AL-I的致突变性。然后每天一次经口给予CB6F1-Tg.rasH2转基因小鼠AL-126周,对AL-I在转基因小鼠体内的潜在致癌作用进行初探。同时采用CB6F1-Non-Tg.rasH2野生型小鼠进行伴随的毒代动力学研究,分析AL-I的毒代动力学特点;此外,伴随进行了 CB6F1-Tg.rasH2转基因小鼠外周血Pig-a突变、外周血微核和多脏器彗星（Comet）检测分析。为解释毒代动力学结果和毒性靶器官,开展了 AL-I的小鼠组织分布研究。第二部分:在第一部分的基础上,采用二代测序（Next Generation Sequencing,NGS）技术,进一步探索诱变剂诱导PIG-A基因突变的机制,探索TK6细胞的PIG-A突变新实验方法中表型结果与基因型突变之间的关系,为确定体外PIG-A基因突变方法的有效性提供理论依据。本课题的主要结果如下:AA-I在4h+S9条件下,体外TK6细胞PIG-A突变阳性;AL-I在4h+S9和24h-S9条件下,体外TK6细胞PIG-A突变均是阴性结果。在AL-I经口给予Tg.rasH2转基因小鼠26周转基因致癌实验中,未见与AL-I相关的血清生化、脏器重量和肿瘤病变,与给予AL-I相关的毒性表现有体瘦、体重减低或增长缓慢、肾小管空泡化的非肿瘤病变;伴随的血微核、血Pig-a、彗星（血、肝脏和肾脏）结果为阴性。采用验证的分析方法确认伴随毒代的动物血浆中无AL-I暴露,组织分布结果提示部分入血的AL-I迅速分布到组织中。全基因组测序（wholegenomesequencing,WGS）分析发现12个分选的“PIG-A阳性”克隆中,4/12例PIG-L突变,2/12例PIG-A突变和2/12例PIG-V突变,故TK6细胞位于X染色体上的PIG-A突变、位于常染色体上的PIG-L缺失和PIG-V突变共同贡献了糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚缺陷,提示TK6细胞“PIG-A”致突变研究可增加检测的突变类型。初步得到以下结论:在本实验条件下,AL-I体外TK6细胞PIG-A突变实验结果阴性;AL-I对Tg.rasH2转基因小鼠无致癌性,伴随的体内遗传毒性终点也未见致突变、致断裂和致DNA损伤作用。此外,从突变机制上证实了 TK6细胞体外PIG-A突变的实验系统的有效性。