目的:明确KDM4B在结直肠癌细胞葡萄糖代谢中的功能。方法:1、构建KDM4B高表达质粒,筛选KDM4B特异性si RNA,并在结直肠癌细胞系中验证其有效性。2、在结直肠癌细胞中低表达KDM4B,运用流式细胞仪,PI染色检测细胞周期变化,Brd U掺入检测细胞增殖变化。3、在结直肠癌细胞中高/低表达KDM4B,运用2-脱氧葡萄糖摄取实验检测葡萄糖摄取效率变化,运用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP总量变化。4、对低表达KDM4B的结直肠癌肿瘤细胞用无葡萄糖培养基饥饿处理后给予高糖刺激,提取细胞蛋白,运用Western Blot方法检测细胞内葡萄糖反应蛋白TXNIP的表达量变化。结果:1、在结直肠癌细胞系中证明了KDM4B高表达质粒可以使KDM4B在蛋白水平明显高表达;筛选出两条特异性si RNA,可以使KDM4B在蛋白水平明显低表达。2、在结直肠癌细胞中将KDM4B低表达后,细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞数目明显减少;Brdu掺入实验表明,KDM4B低表达后,Brdu阳性细胞比例明显降低,说明细胞增殖能力下降。3、2-脱氧葡萄糖摄取实验表明KDM4B低表达后,结直肠癌细胞摄取葡萄糖的能力明显下降,高表达KDM4B后,其摄取葡萄糖能力明显增高;同时KDM4B低表达可导致细胞ATP总量明显下降,高表达KDM4B可使细胞内ATP总量明显升高。4、KDM4B低表达的结直肠癌细胞饥饿处理进而给予高糖刺激后,其细胞内葡萄糖反应蛋白TXNIP升高水平与对照组相比明显降低,说明KDM4B低表达可以抑制葡萄糖的摄取。结论:KDM4B可以促进结直肠癌细胞葡萄糖摄取能力进而促进细胞增殖。目的:探究KDM4B调控结直肠癌细胞葡萄糖代谢的可能分子机制。方法:在结肠癌细胞系中,1、将KDM4B分别低表达和高表达,利用Western Blot方法检测检测GLUT1表达量的变化情况,同时检测AKT在苏氨酸308位和丝氨酸473位磷酸化水平的变化情况。2、将KDM4B低表达后,转入AKT持续激活型突变载体myr-AKT质粒,利用Western Blot方法检测AKT在苏氨酸308位(Thr 308)和丝氨酸473位(Ser 473)磷酸化水平的变化情况,同时检测GLUT1表达量的变化情况。3、将KDM4B高表达后,加入PI3K的活性抑制剂LY294002,利用Western Blot方法检测AKT在苏氨酸308位和丝氨酸473位磷酸化水平的变化情况,同时检测GLUT1表达量的变化情况。4、将KDM4B低表达后进行胞质胞膜分离实验,检测细胞膜上AKT在苏氨酸308位和丝氨酸473位磷酸化水平的变化情况。5、将KDM4B低表达后,利用免疫荧光技术,在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察KDM4B和AKT的分布情况。6、将KDM4B低表达后,转入带His标签的泛素质粒(His-Ub)和带HA标签的AKT质粒(HA-AKT),在不加蛋白酶抑制剂MG132的情况下,利用定量免疫共沉淀(定量IP)技术,检测AKT非降解途径的泛素化变化情况。7、在胰岛素样生长因子1(IGF-1)的刺激下,利用定量IP技术检测KDM4B与TRAF6是否结合。8、将KDM4B低表达后将AKT持续激活,分别利用克隆形成实验,PI染色周期检测,Brd U掺入实验、葡萄糖摄取实验,观察细胞增值能力和葡萄糖摄取能力变化情况。9、购买KDM4B低表达及持续激活型AKT慢病毒后,构建KDM4B低表达稳转株,AKT持续激活稳转株及同时KDM4B低表达和AKT持续激活稳转株,进行小鼠皮下成瘤实验,观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,测量肿瘤重量。结果:在结肠癌细胞系中,1、KDM4B低表达可使GLUT1表达量降低;KDM4B高表达可使GLUT1表达量升高,这说明KDM4B可通过调控GLUT1的表达量来影响葡萄糖摄取能力。2、KDM4B低表达可使AKT在Thr 308位和Ser 473位磷酸化水平明显降低,KDM4B高表达可使AKT在Thr 308位和Ser 473位磷酸化水平明显升高,这说明KDM4B可能通过调控AKT信号通路来调控GLUT1的表达。3、将KDM4B低表达后,再将AKT持续激活,我们可以看到,AKT持续激活可以逆转KDM4B低表达对GLUT1表达量的影响;同样的,将KDM4B高表达后,加入PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002后,可以逆转KDM4B高表达对于GLUT1表达量的影响。这说明KDM4B可通过AKT信号通路影响GLUT1的表达。4、将KDM4B低表达后,位于细胞膜上的AKT在Thr 308位和Ser 473位磷酸化水平明显降低,这提示KDM4B可能影响AKT活化过程中的重要一步——膜转位。5、将KDM4B低表达,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜可以观察到与对照组相比,KDM4B低表达组聚集在膜上的AKT含量明显减少,直观的证明了KDM4B可以影响AKT的膜转位。6、将KDM4B低表达后,在不加蛋白酶体抑制剂MG132的情况下,KDM4B可使AKT的非降解途径的泛素化水平降低。7、在IGF-1的刺激下,随着刺激时间的延长,KDM4B与TRAF6的结合逐渐增多,证明了KDM4B可以与TRAF6相结合。8、将KDM4B低表达后,再将AKT持续激活,我们可以观察到,AKT持续激活可以逆转低表达KDM4B对于细胞葡萄糖摄取能力和细胞增殖能力的抑制作用。9、在小鼠成瘤实验中,我们也可以观察到,KDM4B可以使细胞成瘤能力降低,但将AKT持续激活后,AKT的持续激活可以逆转KDM4B低表达对于细胞成瘤能力的影响。结论:KDM4B可以通过与TRAF6的结合,调控AKT的膜转位,进而调控AKT的磷酸化,调控下游GLUT1的表达,调控细胞葡萄糖代谢。目的:明确KDM4B的表达与结直肠癌患者预后的关系方法:1、购买上海芯超公司结直肠癌组织芯片,此芯片包含80对结直肠肿瘤组织及对应的癌旁正常组织以及单独的20例肿瘤组织,总共100例结直肠肿瘤标本,均具有随访数据。我们将此芯片进行免疫组化实验,检测KDM4B表达情况,运用Kaplan-Meier法,Log Rank统计检验分析其与预后的关系;运用TCGA数据库,分析KDM4B表达与预后的关系。2、根据患者相关资料,分析KDM4B表达与患者性别、年龄、肿瘤大小及病理分期的相关性。结果:1、通过统计分析,KDM4B在结直肠癌中高表达,并且KDM4B与患者预后密切相关,KDM4B高表达提示患者预后不良,生存时间较短。2、KDM4B表达情况与肿瘤T分期及临床分期密切相关,KDM4B高表达,提示T分期及临床分期较晚。结论:KDM4B可以作为预测结直肠癌患者预后的重要指标,KDM4B高表达提示临床分期较晚,预后不良。目的:阐明腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式的技术要点,论证其可重复性。方法:收集2014年12月至2017年12月在华中科技大学同济医院附属同济医院胃肠外科行腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式患者手术资料,筛选出II期和III期的病人进入本研究,分析这部分病人的手术录像,总结手术规律,运用手术示意图和腔镜手术图片的方式,分区域描述右半结肠系膜与系膜床的关系,详细阐述D3+CME手术的技术要点,解剖标识,总结技术规律。结果:2014年12月至2017年12月,腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式II期和III期的患者为110人,通过分析这部分病人的手术录像,我们得到了D3+CME术式的技术要点。右半结肠系膜与系膜床可按照区域划分为三个部分:C部(Central Part),U部(Upper Part)和L部(Lateral Part),在C部,结肠系膜的系膜床为十二指肠及胰头部;在U部,横结肠系膜与胃网膜右系膜互为系膜床;在L部,结肠系膜的系膜床为后腹壁。D3+CME手术从C部进入,沿SMA/SMV向上剥离,完整分离结肠系膜;在U部打开胃结肠韧带,小心分离横结肠系膜与胃网膜右系膜;在L部打开腹膜反折,沿系膜与系膜床的融合间隙由回盲部向上分离结肠系膜与后腹壁至肝曲,整体移除右半结肠。通过110例腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式实施,D3+CME术式展现的系膜与系膜床的关系稳定,手术方法可实现格式化操作,简单,准确,重复率高。结论:右半结肠系膜与系膜床可分为C、U、L部,手术由C部至U部至L部,依次分离系膜与系膜床,既可以保证D3淋巴结的彻底清扫,又可以达到CME对于结肠系膜的完整性的要求;D3+CME手术解剖标识清楚,手术步骤格式化操作,简单,准确,重复性高。目的:明确腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式的外科学效果。方法:收集2014年12月至2017年12月在华中科技大学同济医院附属同济医院胃肠外科行腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式及传统D3/CME术式的患者资料,筛选出II期和III期的病人,记录患者的一般资料、术中情况、病理结果、术后恢复情况,分析D3+CME术式与传统D3/CME术式的差异。结果:2014年12月至2017年12月,II期和III期的腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式患者为110人,腹腔镜右半结肠切除术传统手术D3/CME术式患者为168人。两组患者的性别,年龄,身体质量指数(BMI),肿瘤的位置等均无明显差异;D3+CME手术组患者的术中出血量为7.89±3.84ml,D3/CME手术组为22.96±7.89ml;D3+CME手术组患者手术时间为110.2±17.4min,D3/CME手术组为73.33±19.05min;D3+CME手术组患者淋巴结获取数目为28.26±15.53个,D3/CME手术组为18.65±9.85个;D3+CME手术组患者术后并发症为20.9%,D3/CME手术组患者为23.2%;D3+CME手术组患者术后住院时间为10.73±3.67天,D3/CME组为10.4±2.8天。结论:腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式与传统D3/CME术式相比,术中出血量明显降低,获取的淋巴结数目明显增多,术后并发症较低,但手术时间较长,术后住院时间无明显差距。目的:明确腹腔镜右半结肠切除术D3+CME术式的解剖学基础方法:在腹腔镜右半结肠切除术D3+CME手术过程中,对系膜和系膜床的不同部位进行钛夹标记,术后在标记处剪取1cm2大小组织,4%多聚甲醛固定,行HE染色和免疫组化(总细胞角蛋白),判断间皮细胞和血管分布,明确系膜与系膜床之间的组织结构。结果:我们收集了90例进行腹腔镜右半结肠切除术D3+CME手术患者的标本,总结了膜解剖的基本规律:1、系膜与系膜床表面均由含有间皮细胞的浆膜和含有纤维结缔组织的筋膜构成。2、系膜与系膜床在融合过程中,逐渐形成了系膜与系膜床的五层结构,即筋膜-退化的浆膜-融合间隙-退化的浆膜-筋膜。3、系膜与系膜床的融合具有不均一性,表现为退化的浆膜中间皮细胞分布的不同。4、血管主要分布于筋膜与筋膜之间,浆膜与浆膜之间血管较少分布。结论:系膜与系膜床表面均由浆膜与筋膜构成,系膜与系膜床融合时浆膜退化成为不完全的浆膜,并且融合具有不均一性;血管主要分布于筋膜与筋膜之间,浆膜与浆膜之间血管较少分布。