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研究背景：
甲状腺癌(thyroid cancer，TC)是内分泌恶性肿瘤的一种。统计显示，甲状腺癌的发病率在全球范围内逐年增加。除去体检筛查早期大量发现的原因外，发病率也实际大幅提升。甲状腺癌发病率的危险因素主要包括外生性因素(暴露于电离辐射、碘摄入量,生活方式的改变和环境污染物)和内源性因素(促甲状腺激素水平、自身免疫性甲状腺炎,肥胖和胰岛素抵抗)。甲状腺癌患者通常没有感受到明显的发病症状，虽然甲状腺癌手术治疗和激素抑制疗法以及靶向药物的发明，使得该病总体预后良好，然而对于部分局部侵袭，多发淋巴结转移，局部复发和出现远处转移的病例，目前仍然没有完全有效的方案治愈。因此，继续寻找行之有效的治疗手段是甲状腺癌急需解决的问题。
长链非编码RNA(long non?coding RNA，LncRNA)是一类转录后长度大于200核苷酸，但不具备有编码蛋白功能的RNA分子。最近的研究显示LncRNAs的异常表达在不同类型肿瘤中体现出抑癌基因和促癌基因的效应。此外，随着研究的逐步深入，LncRNAs被证实具有调节细胞生长、凋亡、细胞周期进展、分化和细胞凋亡等许多生物功能。LncRNALINC00312(LINC00312)，也叫NAG7，位于染色体3p25.3位置，已经在许多肿瘤中被证明是一个抑癌基因。此外，先前的研究还证实，LINC00312可能是预测鼻咽癌转移和预后的生物标志物。
微小RNA(microRNA，miRNA)也是一类短序列、非编码RNA分子，通过特殊的机制调节肿瘤的发生发展。miRNA-197-3p(miR-197-3p)属于miR-197家族的一员，被证实在原发性胆汁性肝硬化中低表达。在基底细胞癌中，miR-197-3p高表达，从而抑制角化细胞增殖和迁移。研究显示膀胱癌中LINC00312与miR-197-3p负相关，LINC00312可以通过下调miR-197-3p表达抑制膀胱癌细胞的浸润和转移。已有研究显示甲状腺癌中LncRNAs和microRNA显著相关，LncRNAH19调节通过结合miR-17-5p和miR-146a调控YES1表达诱导甲状腺癌发生。然而，LINC00312和miR-197-3p在甲状腺癌中的相关性还未有过研究。
PI3K/Akt(phosphatidylinositol3-hydroxy kinase/protein kinase B)通路在甲状腺癌、前列腺癌和胃癌等多种癌症发生和侵袭中发挥着重要作用。同时这种信号通路也在调节细胞增殖、分化、分裂，促进肿瘤无限增殖中扮演着重要角色。以往的证据表明，甲状腺癌中通常发生PI3K/Akt信号通路相关因子的遗传变化，PI3K/Akt信号通路被证明是一个治疗甲状腺癌的潜在靶标。由此可知PI3K/Akt信号通路和TC具有紧密的联系，但是甲状腺癌中LINC00312和PI3K/Akt信号通路的确切关系还有待探索。
基于此，我们通过检测LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达，进一步分析其与甲状腺癌侵袭和转移的关系，并探究其可能的调控机制，为进一步寻找新甲状腺癌的发病机制和治疗靶点奠定基础。
方法：
一、LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达及其临床关系
选取2013年10月-2015年8月于我院首次行手术切除并经病理确诊甲状腺癌患者组织标本211例，同时选取甲状腺瘤肿块旁2cm组织标本70例作为对照。组织标本用福尔马林固定，石蜡包埋。qRT-PCR检测癌组织、癌旁组织以及人甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株中LINC00312表达水平，采用统计分析法对甲状腺癌组织中LINC00312表达水平与患者临床病理特征的关系。
二、LncRNALINC00312调控PI3K/AKT信号通路影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
构建相应表达质粒并转染甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株，分为5组：空白组(Blank组)、对照组(Control vectors)、LINC00312vectors组、si-control组、si-LINC00312组。RT-PCR法检测各组细胞中LINC00312表达情况。荧光显微镜观察各组细胞转染效率，我们通过CCK-8法和Edu法检测各组转染细胞增殖情况，Transwell实验检测各组转染细胞侵袭能力，通过Westernblotting检测了PI3K，t-Akt和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白的表达水平。通过各组细胞裸鼠成瘤实验，研究各组细胞体内成瘤能力及移植瘤增殖和侵袭的影响。
三、LncRNALINC00312调控miR-197-3p影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
我们通过荧光定量PCR检测甲状腺癌组织和癌旁组织及细胞中的miR-197-3p表达情况，分析LINC00312和miR-197-3p表达水平的相关性。分析miR-197-3p与甲状癌临床病理的关系，随后通过生物信息学软件预测miR-197-3p与p120的靶向关系，并通过qRT-PCR、Westernblot及双荧光素酶报告基因系统验证；构建相应表达质粒，并转染甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株，分为5组：空白组、阴性对照组、LINC00312组、miR-197-3pinhibitors组、LINC00312过表达+miR-197-3pmimics组。RT-PCR法和Westernblot法检测各组细胞中LINC00312、miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达情况。Transwell实验和划痕实验检测各组转染细胞迁移侵袭能力。通过各组细胞裸鼠成瘤实验，研究各组细胞体内成瘤能力的影响。
结果：
一、LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达及其临床关系
1、与癌旁正常组织相比，甲状腺癌组织中LINC00312表达水平明显降低，与正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1相比，甲状腺癌细胞中LINC00312的表达水平明显降低。(均P<0.05)。
2、LINC00312表达水平在淋巴转移甲状腺癌患者中的表达水平低于无淋巴转移甲状腺癌患者，在肿瘤分期III/IV期患者中的表达水平低于I/II期患者，在肿瘤直径≥1.0cm患者中表达水平低于<1.0cm患者(均P<0.05)。
二、LncRNALINC00312调控PI3K/AKT信号通路影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
1、过表达LINC00312后甲状腺癌细胞的增殖能力减弱，低表达LINC00312后甲状腺癌细胞的增殖能力增强(均P<0.05)。
2、K1,FTC-133和8505C细胞过表达LINC00312后侵袭能力均下降，MMP9蛋白表达降低(均P<0.05)，而低表达后侵袭能力提高，MMP9蛋白表达升高(均P<0.05)。
3、过表达LINC00312使甲状腺癌细胞PI3K和p-Akt表达水平显著下降(均P<0.05)，低表达LINC00312使甲状腺癌细胞PI3K和p-Akt表达水平显著升高(均P<0.05)，而t-Akt的表达水平无明显影响(均P>0.05)。
4、LY294002(PI3K/Akt信号通路的一种抑制剂)能使甲状腺癌细胞LINC00312低表达或高表达诱导的MMP9表达引起的作用减弱。
5、裸鼠移植瘤实验结果显示，过表达组皮下肿瘤的生长受到明显抑制，低表达组的肿瘤生长则明显增加；过表达LINC00312降低了MMP9的阳性表达及PI3K和p-Akt蛋白在组织中表达，低表达能增加MMP9的阳性的表达率及PI3K和p-Akt蛋白在组织中表达。
三、LncRNALINC00312调控miR-197-3p影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
1、与甲状腺癌旁正常组织比较，miR-197-3p在甲状腺癌组织中表达上调，miR-197-3p在甲状腺癌中的表达与组织分型、TNM分期、有无淋巴结转移及肿瘤直径有关(均P<0.05)。
2、就单个转染组别而言，8505C细胞LINC00312及p120mRNA和蛋白表达量最低，miR-197-3p表达量最高；K1细胞LINC00312及p120mRNA和蛋白表达量最高，miR-197-3p表达量最低；FTC-133细胞LINC00312、miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达量处于两者之间，差异有统计学意义(均P<0.05)。
3、与空白组和阴性对照组相比，LINC00312组LINC00312表达上调，使miR-197-3p表达下调，同时上调p120mRNA及蛋白的表达(均P<0.05)；miR-197-3pinhibitors组使miR-197-3p表达下调的同时，促进p120表达(均P<0.05)；LINC00312+miR-197-3pmimics组共转染组与空白组miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达无显著差异(均P>0.05)。
4、与空白组和阴性对照组比较，LINC00312组和miR-197-3pinhibitors组均能抑制甲状腺癌细胞的侵袭和迁移能力。LINC00312过表达和miR-197-3pinhibitors均抑制甲状腺癌细胞在体内成瘤能力，miR-197-3pmimics可逆转LINC00312过表达对甲状腺癌细胞体内成瘤能力的影响。
结论：
甲状腺癌中LncLINC00312通过下调miR-197-3p及抑制PI3K/AKT信号通路，抑制甲状腺癌侵袭和转移；LINC00312可能是甲状腺癌治疗方案的潜在靶点。
甲状腺癌(thyroid cancer，TC)是内分泌恶性肿瘤的一种。统计显示，甲状腺癌的发病率在全球范围内逐年增加。除去体检筛查早期大量发现的原因外，发病率也实际大幅提升。甲状腺癌发病率的危险因素主要包括外生性因素(暴露于电离辐射、碘摄入量,生活方式的改变和环境污染物)和内源性因素(促甲状腺激素水平、自身免疫性甲状腺炎,肥胖和胰岛素抵抗)。甲状腺癌患者通常没有感受到明显的发病症状，虽然甲状腺癌手术治疗和激素抑制疗法以及靶向药物的发明，使得该病总体预后良好，然而对于部分局部侵袭，多发淋巴结转移，局部复发和出现远处转移的病例，目前仍然没有完全有效的方案治愈。因此，继续寻找行之有效的治疗手段是甲状腺癌急需解决的问题。
长链非编码RNA(long non?coding RNA，LncRNA)是一类转录后长度大于200核苷酸，但不具备有编码蛋白功能的RNA分子。最近的研究显示LncRNAs的异常表达在不同类型肿瘤中体现出抑癌基因和促癌基因的效应。此外，随着研究的逐步深入，LncRNAs被证实具有调节细胞生长、凋亡、细胞周期进展、分化和细胞凋亡等许多生物功能。LncRNALINC00312(LINC00312)，也叫NAG7，位于染色体3p25.3位置，已经在许多肿瘤中被证明是一个抑癌基因。此外，先前的研究还证实，LINC00312可能是预测鼻咽癌转移和预后的生物标志物。
微小RNA(microRNA，miRNA)也是一类短序列、非编码RNA分子，通过特殊的机制调节肿瘤的发生发展。miRNA-197-3p(miR-197-3p)属于miR-197家族的一员，被证实在原发性胆汁性肝硬化中低表达。在基底细胞癌中，miR-197-3p高表达，从而抑制角化细胞增殖和迁移。研究显示膀胱癌中LINC00312与miR-197-3p负相关，LINC00312可以通过下调miR-197-3p表达抑制膀胱癌细胞的浸润和转移。已有研究显示甲状腺癌中LncRNAs和microRNA显著相关，LncRNAH19调节通过结合miR-17-5p和miR-146a调控YES1表达诱导甲状腺癌发生。然而，LINC00312和miR-197-3p在甲状腺癌中的相关性还未有过研究。
PI3K/Akt(phosphatidylinositol3-hydroxy kinase/protein kinase B)通路在甲状腺癌、前列腺癌和胃癌等多种癌症发生和侵袭中发挥着重要作用。同时这种信号通路也在调节细胞增殖、分化、分裂，促进肿瘤无限增殖中扮演着重要角色。以往的证据表明，甲状腺癌中通常发生PI3K/Akt信号通路相关因子的遗传变化，PI3K/Akt信号通路被证明是一个治疗甲状腺癌的潜在靶标。由此可知PI3K/Akt信号通路和TC具有紧密的联系，但是甲状腺癌中LINC00312和PI3K/Akt信号通路的确切关系还有待探索。
基于此，我们通过检测LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达，进一步分析其与甲状腺癌侵袭和转移的关系，并探究其可能的调控机制，为进一步寻找新甲状腺癌的发病机制和治疗靶点奠定基础。
方法：
一、LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达及其临床关系
选取2013年10月-2015年8月于我院首次行手术切除并经病理确诊甲状腺癌患者组织标本211例，同时选取甲状腺瘤肿块旁2cm组织标本70例作为对照。组织标本用福尔马林固定，石蜡包埋。qRT-PCR检测癌组织、癌旁组织以及人甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株中LINC00312表达水平，采用统计分析法对甲状腺癌组织中LINC00312表达水平与患者临床病理特征的关系。
二、LncRNALINC00312调控PI3K/AKT信号通路影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
构建相应表达质粒并转染甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株，分为5组：空白组(Blank组)、对照组(Control vectors)、LINC00312vectors组、si-control组、si-LINC00312组。RT-PCR法检测各组细胞中LINC00312表达情况。荧光显微镜观察各组细胞转染效率，我们通过CCK-8法和Edu法检测各组转染细胞增殖情况，Transwell实验检测各组转染细胞侵袭能力，通过Westernblotting检测了PI3K，t-Akt和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白的表达水平。通过各组细胞裸鼠成瘤实验，研究各组细胞体内成瘤能力及移植瘤增殖和侵袭的影响。
三、LncRNALINC00312调控miR-197-3p影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
我们通过荧光定量PCR检测甲状腺癌组织和癌旁组织及细胞中的miR-197-3p表达情况，分析LINC00312和miR-197-3p表达水平的相关性。分析miR-197-3p与甲状癌临床病理的关系，随后通过生物信息学软件预测miR-197-3p与p120的靶向关系，并通过qRT-PCR、Westernblot及双荧光素酶报告基因系统验证；构建相应表达质粒，并转染甲状腺癌K1(甲状腺乳头状癌)、FTC-133(人滤泡性甲状腺癌细胞)和8505C(甲状腺未分化癌)细胞株，分为5组：空白组、阴性对照组、LINC00312组、miR-197-3pinhibitors组、LINC00312过表达+miR-197-3pmimics组。RT-PCR法和Westernblot法检测各组细胞中LINC00312、miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达情况。Transwell实验和划痕实验检测各组转染细胞迁移侵袭能力。通过各组细胞裸鼠成瘤实验，研究各组细胞体内成瘤能力的影响。
结果：
一、LncRNALINC00312在甲状腺癌组织中的表达及其临床关系
1、与癌旁正常组织相比，甲状腺癌组织中LINC00312表达水平明显降低，与正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1相比，甲状腺癌细胞中LINC00312的表达水平明显降低。(均P<0.05)。
2、LINC00312表达水平在淋巴转移甲状腺癌患者中的表达水平低于无淋巴转移甲状腺癌患者，在肿瘤分期III/IV期患者中的表达水平低于I/II期患者，在肿瘤直径≥1.0cm患者中表达水平低于<1.0cm患者(均P<0.05)。
二、LncRNALINC00312调控PI3K/AKT信号通路影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
1、过表达LINC00312后甲状腺癌细胞的增殖能力减弱，低表达LINC00312后甲状腺癌细胞的增殖能力增强(均P<0.05)。
2、K1,FTC-133和8505C细胞过表达LINC00312后侵袭能力均下降，MMP9蛋白表达降低(均P<0.05)，而低表达后侵袭能力提高，MMP9蛋白表达升高(均P<0.05)。
3、过表达LINC00312使甲状腺癌细胞PI3K和p-Akt表达水平显著下降(均P<0.05)，低表达LINC00312使甲状腺癌细胞PI3K和p-Akt表达水平显著升高(均P<0.05)，而t-Akt的表达水平无明显影响(均P>0.05)。
4、LY294002(PI3K/Akt信号通路的一种抑制剂)能使甲状腺癌细胞LINC00312低表达或高表达诱导的MMP9表达引起的作用减弱。
5、裸鼠移植瘤实验结果显示，过表达组皮下肿瘤的生长受到明显抑制，低表达组的肿瘤生长则明显增加；过表达LINC00312降低了MMP9的阳性表达及PI3K和p-Akt蛋白在组织中表达，低表达能增加MMP9的阳性的表达率及PI3K和p-Akt蛋白在组织中表达。
三、LncRNALINC00312调控miR-197-3p影响甲状腺癌侵袭和转移的机制研究
1、与甲状腺癌旁正常组织比较，miR-197-3p在甲状腺癌组织中表达上调，miR-197-3p在甲状腺癌中的表达与组织分型、TNM分期、有无淋巴结转移及肿瘤直径有关(均P<0.05)。
2、就单个转染组别而言，8505C细胞LINC00312及p120mRNA和蛋白表达量最低，miR-197-3p表达量最高；K1细胞LINC00312及p120mRNA和蛋白表达量最高，miR-197-3p表达量最低；FTC-133细胞LINC00312、miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达量处于两者之间，差异有统计学意义(均P<0.05)。
3、与空白组和阴性对照组相比，LINC00312组LINC00312表达上调，使miR-197-3p表达下调，同时上调p120mRNA及蛋白的表达(均P<0.05)；miR-197-3pinhibitors组使miR-197-3p表达下调的同时，促进p120表达(均P<0.05)；LINC00312+miR-197-3pmimics组共转染组与空白组miR-197-3p及p120mRNA和蛋白表达无显著差异(均P>0.05)。
4、与空白组和阴性对照组比较，LINC00312组和miR-197-3pinhibitors组均能抑制甲状腺癌细胞的侵袭和迁移能力。LINC00312过表达和miR-197-3pinhibitors均抑制甲状腺癌细胞在体内成瘤能力，miR-197-3pmimics可逆转LINC00312过表达对甲状腺癌细胞体内成瘤能力的影响。
结论：
甲状腺癌中LncLINC00312通过下调miR-197-3p及抑制PI3K/AKT信号通路，抑制甲状腺癌侵袭和转移；LINC00312可能是甲状腺癌治疗方案的潜在靶点。