在石油开采和加工的过程中所产生的落地油和石油类加工产品污染物质对土壤环境造成了非常严重的危害,存在于土壤中的石油类污染物质大部分为烃类(烷烃、环烷烃和芳香烃),其中甲苯是常见的芳香烃类物质,甲苯及其氧化产物苯甲酸会对土壤生物造成一系列的影响。由于目前对甲苯和苯甲酸的探讨多倾向于对人体的毒性和致病机制的研究,对于土壤生态系统生物的毒性影响研究甚少,急需建立一种污染物毒性评价的新方法和模型,并为预防石油类污染物对土壤生物健康的影响提供技术支持和理论参考。而且以往关于石油类污染物对蚯蚓的毒性作用研究大多在动物层面,部分研究涉及到了石油类污染物对机体内酶的表观活性的影响,而对表观活性变化的原因并没有进一步进行解释。本论文从细胞和分子层面对甲苯和苯甲酸引起蚯蚓氧化应激的机理进行探究。文章主要分为以下三个部分。第一部分:选取赤子爱胜蚓的体细胞作为靶细胞,选取了四种衡量氧化应激的重要生物标志物:总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、CAT(过氧化氢酶)和SOD(超氧化物歧化酶),在细胞水平上研究了甲苯和苯甲酸诱导蚯蚓体细胞发生氧化应激的机制。结果表明,随着甲苯和苯甲酸的加入,相比对照组,体细胞总抗氧化能力呈现轻微上升,当苯甲酸浓度达到6× 10-5 M,甲苯浓度达到15 X 10-5M时,相比对照组体细胞总抗氧化能力出现降低,因为体细胞的抗氧化系统无法抵御甲苯和苯甲酸引起的氧化应激,大量的活性氧自由基诱发氧化损伤,所以造成了体细胞总抗氧化能力降低。随着甲苯和苯甲酸作用浓度的增加,体细胞中的MDA生成量呈上升趋势,并且当甲苯浓度大于15×10-5M,苯甲酸浓度大于6X 10-5M时,MDA的生成量上升且具有统计学显著性。MDA的结果表明,甲苯和苯甲酸诱导蚯蚓原代体细胞发生了氧化应激效应。CAT酶活性实验检测结果显示,不同浓度的甲苯暴露情况下蚯蚓体细胞内CAT相对活性变化,呈现了先轻微升后下降的趋势,抑制了酶的活性。不同浓度的苯甲酸暴露情况下蚯蚓体细胞内CAT相对活性变化,呈现了轻微先升高后轻微下降的趋势,没有显著性变化,说明苯甲酸对CAT的酶活性影响不大。SOD酶活性实验检测结果显示,不同浓度的甲苯暴露情况下蚯蚓细胞内SOD相对活性变化,呈现先轻微升高后轻微下降的趋势且没有显著性变化,说明苯甲酸对CAT的酶活性影响不大。不同浓度的苯甲酸暴露情况下蚯蚓体细胞内SOD相对活性变化,呈现了上升的趋势,升高到空白对照组的109.3%且具有统计学显著性。甲苯和苯甲酸都能引起蚯蚓体细胞氧化应激效应。第二部分:以CAT为研究蛋白,采用多种光谱法、分子对接和酶活性测定等方法,探讨甲苯和苯甲酸对CAT结构和功能的影响。结果显示甲苯和苯甲酸对CAT毒性作用导致CAT芳香族氨基酸微环境发生变化,CAT的骨架结构松散,发生去折叠现象,破坏了 CAT的氢键网络,影响了蛋白质的二级结构,造成了肽链的错误折叠和部分变性。MOE结果显示甲苯与过氧化氢进入CAT活性中心通道上的谷氨酰胺(Gln 167)和天冬氨酸(Asp 127)发生作用,阻止H2O2顺利进入CAT活性中心,最终导致CAT的酶活性下降;苯甲酸并没有与CAT活性中心直接结合,所以对酶活性影响很小,这与酶活性测定的结果相符合。第三部分:以超氧化物歧化酶(SOD)为研究蛋白,采用多种光谱法、分子对接和酶活性测定等方法,探讨甲苯和苯甲酸对SOD结构和功能的影响。结果显示甲苯和苯甲酸与SOD分子的相互作用都导致SOD的骨架结构松散,发生去折叠现象,影响了蛋白质的二级结构,造成了肽链的错误折叠和部分变性,但SOD分子芳香族氨基酸残基所处的微环境并未受到影响。对接的结果表明甲苯并没有与SOD活性中心直接结合,结合在SOD的两个亚基的交界面处,所以对酶活性影响很小,这与酶活性测定的结果相符合;对接的结果显示苯甲酸更容易在SOD的分子表面碰撞和结合,苯甲酸与SOD发生相互作用后导致了 SOD的构象发生变化,SOD活性位点附近的入口增大,增大了 SOD的活性位点与底物的接触面积,最终导致SOD活性上升。