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目前,在花色基因工程育种中,蓝色花卉因其色彩高雅、稀少而成为研究的重点。其中,翠雀素衍生的花色素苷的积累被认为是产生蓝色花的三个必备条件之一。因此向非蓝色花植物中引入编码翠雀素的关键基因成为培育蓝色花卉品种的一个重要手段。 类黄酮3,5羟基化酶(flavonoid-3’,5’-hydoxylase;F3’5’H)被认为是合成翠雀素糖苷的关键酶。大多数天然蓝色花是由于F3’5’H基因的有效表达,通过导入外源基因为蓝色花的培育提供了可能性。本研究根据基因库登陆F3’5’H序列设计特异引物,从瓜叶菊中扩增F3’5’H基因,RT—PCR扩增得到大约1500bp大小的特异片断,将其克隆到载体pMD 18—T。经菌落PCR和酶切检测并测序,确认得到了类黄酮3,5羟基化酶(F3’5’H)基因。 查尔酮合成酶基因(Chalcone synthase;CHS)是植物体类黄酮合成的关键基因。CHS启动子具有很强的花瓣特异表达特性,在花卉的花色基因工程育种中有着重要的应用价值。本实验用改良SDS法提取矮牵牛的DNA,根据基因库中PchsA登陆序列设计特异引物,从矮牵牛DNA中扩增PchsA启动子。测序结果经比对分析,可以确认得到了启动子PchsA。 利用PCR方法将F3’5’H基因与启动子PchsA从pMD 18—T载体上克隆下来,再将两个片断连接后再连入植物表达载体pBI 121。用pBI 121转化农杆菌LBA4404。 建立菊花的转化体系:OD值为0.5左右的农杆菌菌液,浸染时间为7min,共培养3d可提高农杆菌转化效率,在抗生素浓度为Kan 50mg/L,Carb 500mg/L的培养基上可以有效地筛选转基因菊花。