论文部分内容阅读
目的:以人肝癌细胞株HepG2细胞株为体外模型，观察外源性转化生长因子TGF-β1作用下人肝癌细胞的存活以及凋亡情况、人C2H2型锌脂蛋白基因ZNF580表达情况，分析在ZNF580基因过表达和siRNA干扰ZNF580表达状态下与TGF-β1共同调节凋亡相关基因，人胱天蛋白酶-3（Human Caspase-3，Caspase-3）、Bax、B细胞淋巴瘤-2基因(B celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表达量的改变以及细胞凋亡的变化情况。
方法:
1、培养人肝癌细胞HepG2细胞接种到六孔板中在各孔内加TGF-β1不同浓度、不同时间提取细胞RNA和蛋白，每组设三个平行孔，RT-PCR及western blot鉴定外源性TGF-β1作用下ZNF580基因表达的时间、剂量曲线，以确定TGF-β1诱导的最佳浓度及作用时间。
2、运用脂质体转染技术将过表达质粒pEGFP-ZNF580及其对照质粒pEGFP-C1、siRNA干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-ZNF580-491及其对应错义质粒PGPU6/GFP/Neo-UC分别转染HepG2细胞并观察转染效率，流式细胞术分选纯化转染后细胞，RT-PCR以及western blot鉴定ZNF-580基因表达量。
3、以确定的TGF-β1最佳浓度和时间处理转染后细胞，RT-PCR以及western blot检测Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的表达变化，荧光双染技术、流式细胞术观察在TGF-β1诱导下细胞的凋亡变化情况。
结果:
1.不同浓度TGF-β1作用HepG2细胞后，当浓度为4 ng/ml时ZNF580基因表达达到最低值(P＜0.05);4 ng/ml的TGF-β1作用HepG2细胞，ZNF580基因表达量在12h达到最低值(P＜0.05)。
2.pEGFP-ZNF580、PGPU6/GFP/Neo-ZNF580-491质粒转染的细胞ZNF580基因表达与原始株有差异(P＜0.05)。成功实现了ZNF580基因在HepG2细胞中的过表达和低表达。
3.荧光双染、流式细胞术可见加入外源性TGF-β1后ZNF580过表达组细胞凋亡率降低、ZNF580低表达组细胞凋亡率升高。
4.RT-PCR及western blot鉴定Bax、Bcl-2、Caspase-3表达量的变化，Bax及Caspase-3基因在ZNF580基因过表达时表达量降低，加入TGF-β1刺激后升高;Bcl-2基因在ZNF-580基因过表达时表达量升高，加入TGF-β1刺激后降低;ZNF580基因低表达时实验结果与过表达组相反。
结论:ZNF580基因在外源性TGF-β1刺激的肿瘤细胞凋亡中具有重要作用，ZNF580基因过表达能诱导Bcl-2基因表达上调、下调Caspase-3、Bax基因表达，抑制TGF-β1所诱导的人肝癌细胞HepG2凋亡，为进一步进行体内实验奠定基础。