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从20世纪70年代初期基因克隆技术建立至今,短短几十年的时间,基因克隆技术发展十分迅猛,迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表达载体中,进行各种研究,以期造福人类。但是,很多生物学功能并不是由一个基因或一种蛋白来控制和完成的,它需要多个相关基因或蛋白的共同作用。多基因共表达在许多领域都有着重要的应用价值和应用前景[1]。多顺反子表达是多基因共表达的一种方法。构建多顺反子表达载体,研究原核生物多顺反子不同间隔区对外源基因表达效率的影响,将对多基因共表达具有一定的指导意义。目前,原核生物间隔区对外源基因表达效率的定量分析尚无报导。本研究从大肠杆菌基因组序列出发,对其多顺反子间隔区多种形式和序列进行分析,选取融合表达、无间隔序列、起始密码子与终止密码子重迭序列TAATG、间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列(GAAGGAGATATACAT)和lacZ和lacY之间天然间隔区(TAATAACCGGGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCGCGTAAGGAAATCCATT)加以研究。在大肠杆菌中构建以β-半乳糖苷酶(GAL)为担体蛋白,绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因的双顺反子表达载体pET28a-lacZ-gfpD(无间隔序列),pET28a-lacZ-gfpL(间隔序列为起始密码子与终止密码子重迭序列),pET28a-lacZ-gfpR(β-半乳糖苷酶与绿色荧光蛋白融合表达),pET28a-lacZ-gfp15(间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列)及pET28a-lacZ-gfp51(间隔序列为lacZ和lacY之间天然间隔区),同时构建对照质粒pET28a-gfp和pET28a-lacZ。将上述质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达,利用荧光分光光度计对GFP的表达量进行荧光检测,并测定β-半乳糖苷酶的酶活力,最终用蛋白质电泳进行验证。结果显示,双顺反子表达载体中不同的间隔序列不仅对位于下游的顺反子gfp的表达水平有影响,对位于上游的顺反子lacZ的表达水平也有一定的影响。我们设计的这种双顺反子的表达规律是否适用于其他外源基因,还有待于更多的应用来证实,但至少对于双顺反子载体的构建提供了一个借鉴。