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背景和目的痒是一种引起机体抓挠欲望的不愉快感觉,见于多种皮肤性疾病,如皮炎、湿疹和银屑病,也见于多种系统性疾病,如胆汁淤积症、糖尿病和尿毒症。痒严重地影响着人们的生活,但是目前痒的机制并不明确,因此很多类型的痒不能得到有效的治疗。根据产生痒的过程是否需要组胺(Histamine,His)的参与,痒被分为组胺依赖性痒和非组胺依赖性痒。临床上,组胺依赖性痒只占1/4的比例,另外的3/4是非组胺依赖性痒。近期的研究发现,Mas相关G蛋白偶联受体(Mas-related G protein coupled receptor,Mrgpr)与非组胺依赖性痒的产生密切相关,该家族包含50多位成员。其中,MrgprA3被确定为痒觉特异性受体,表达MrgprA3的背根神经节(Doorsal root ganglia,DRG)中的神经元被定义为痒觉特异性神经元,激活该类神经元只产生痒觉而不产生痛觉,剔除这类神经元以后,对痒觉影响明显,对痛觉没有影响。丙酮—乙醚—水(Acetone—Ether—Water,AEW)模型是一个非组胺依赖性痒的模型。AEW模型小鼠的皮肤屏障功能被破坏,水合作用减弱,含水量减少,失水量增加,表现出皮肤干燥、脱屑和瘙痒的症状,又被称为干皮症瘙痒模型。研究证明,瞬时感受器电位(Transient receptor potential,TRP)通道中的TRPA1作为MrgprA3的下游离子通道参与了干皮症瘙痒的形成,但是痒觉特异性受体MrgprA3以及与MrgprA3在DRG上共表达的另外一种TRP通道—TRPV4通道是否与干皮症瘙痒的形成有关,目前没有报道。与MrgprA3只表达在DRG和三叉神经节(Trigeminal Ganglia,TG)中不同,TRPV4在皮肤中也大量表达。西药对于非组胺依赖性痒的治疗效果并不显著,且副作用明显,我们从大量的文献中收集整理了不同的中药止痒方剂,从中选取了当归饮子对其止痒作用进行研究。当归饮子作为养血活血、祛风止痒的经典方剂一直被广泛用于痒的治疗,尤其对血虚风燥型的痒具有良好的治疗作用,但它止痒的机理,目前并不清楚。因此,我们将探讨干皮症瘙痒的形成是否与MrgprA3和TPRV4有关以及当归饮子是否能够抑制干皮症瘙痒。实验方法1利用野生型(Wide type,WT)小鼠进行AEW造模处理,并于造模3天后,在小鼠造模区的颈背部皮内注射MrgprA3的激动剂氯喹(Chloroquine,CQ)。再利用MrgprA3EGFP-Cre;ROSA26tdomat转基因小鼠进行了同样的行为学实验,以此来研究AEW模型小鼠的抓挠行为以及是否对CQ的刺激更加敏感。2利用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,观察AEW模型小鼠表皮厚度的变化。3利用MrgprA3EGFP-Cre;ROSA26tdTomato转基因小鼠,检测造模区皮下MrgprA3+神经纤维密度和支配造模区皮肤的DRG(C6-T10)中MrgprA3+神经元比例在AEW造模前后是否变化,并且利用荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)技术对DRG中MrgprA3在mRNA水平的表达情况进行分析。4利用钙成像技术研究AEW造模前后DRG神经元对CQ刺激的反应比例和反应强度是否变化。5利用TRPV4的抑制剂HC067047对AEW模型小鼠进行腹腔注射(intraperitoneal,ip)以及利用TRP V4-/-小鼠进行AEW造模处理,在行为学水平上探讨AEW模型的形成是否与TRPV4有关。6利用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和蛋白质免疫印迹(Western Bolt,WB)技术研究AEW造模前后皮肤和DRG中TRPV4蛋白表达是否变化。7利用WT小鼠探究当归饮子能否抑制AEW模型小鼠的抓挠行为。8利用HE染色观察当归饮子对AEW模型小鼠表皮厚度的影响。9利用MrgprA3EGFP-Cre;ROS426tdTomato转基因小鼠检测当归饮子对AEW模型小鼠造模区皮下MrgprA3+神经纤维和支配造模区皮肤的DRG(C6-T10)中MrgprA3+神经元的影响,并且对DRG中MrgprA3在mRNA水平的表达情况进行分析。10利用免疫荧光和WB技术探讨当归饮子对AEW模型小鼠DRG中TRPV4+神经元比例及皮肤和DRG中TRPV4蛋白表达的影响。实验结果1 AEW模型小鼠对CQ的刺激更加敏感。MrgpprA3EGFP-Cre;ROSA26tdTomato的行为学结果与野生型小鼠一致。2 AEW模型小鼠表皮明显增厚。3 AEW模型小鼠造模区皮下的MrgprA3+神经纤维密度和支配造模区DRG中的MrgprA3+的神经元比例增加。qPCR的结果也显示,MrgprA3在mRNA水平表达上升。4 AEW模型小鼠的DRG神经元对于CQ刺激的反应比例增加,强度不变。5 AEW模型小鼠的抓挠行为能够被HC067047抑制。相对于WT小鼠,AEW造模处理的TRPV4/-小鼠的抓挠行为显著降低。6 AEW模型小鼠的DRG神经元中TRPV4+神经元比例增加,皮肤和DRG中TRPV4蛋白表达上调。7当归饮子可以抑制AEW模型小鼠的抓挠行为。8当归饮子可以降低AEW模型小鼠的表皮厚度。9当归饮子对AEW模型小鼠皮下MrgprA3+神经纤维密度、DRG中MrgprA3+神经元比例和MrgprA3在mRNA水平的表达没有影响。10当归饮子可以降低AEW模型小鼠DRG中TRPV4+神经元的比例,下调皮肤和DRG中TRPV4蛋白的表达。实验结论干皮症瘙痒的形成与MrgprA3和TRPV4有关。当归饮子抑制干皮症瘙痒可能是通过抑制TRPV4的表达实现的。