【摘 要】
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寄生蜂是一类重要的天敌昆虫。通常情况下,寄生蜂寄生成功后,其后代的正常生长发育,会导致寄主的死亡。在生产上,许多种类的寄生蜂广泛应用于农业害虫防治。其寄生因子,如毒液等可以用来开发新型生防制剂,具有广阔的应用前景。对于卵寄生蜂,其毒液基因研究甚少。因此,为了明确在寄生过程中起作用的关键蛋白,更好的了解寄生蜂与寄主之间的互作机制,并为新的生物防治策略的开发提供依据。本研究以卵寄生蜂-荔枝蝽平腹小蜂(
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寄生蜂是一类重要的天敌昆虫。通常情况下,寄生蜂寄生成功后,其后代的正常生长发育,会导致寄主的死亡。在生产上,许多种类的寄生蜂广泛应用于农业害虫防治。其寄生因子,如毒液等可以用来开发新型生防制剂,具有广阔的应用前景。对于卵寄生蜂,其毒液基因研究甚少。因此,为了明确在寄生过程中起作用的关键蛋白,更好的了解寄生蜂与寄主之间的互作机制,并为新的生物防治策略的开发提供依据。本研究以卵寄生蜂-荔枝蝽平腹小蜂(Anastatus japonicus)为研究对象,探究了荔枝蝽平腹小蜂在26±1℃,75±5%RH,L/D=14/10h条件下的发育历期;利用高倍体视解剖镜确定了雌蜂毒液器官的形态和结构;采用雌蜂转录组和毒液蛋白质组的分析方法,解析了荔枝蝽平腹小蜂的毒液蛋白质组分,并对雌蜂寄生前(Be)和寄生7d后(Af)的毒液蛋白进行了差异分析和特异性分析;并与其他已报道寄生蜂的毒液蛋白进行比对分析,预测了卵寄生蜂-荔枝蝽平腹小蜂寄生过程的假设模型,结果如下:1.在26±1℃,75±5%RH,L/D=14/10h的条件下,寄生柞蚕卵的荔枝蝽平腹小蜂从卵到成虫的发育历期为20-22 d,其中卵期3 d,幼虫期(包括一龄、二龄、三龄和老熟幼虫)6 d,预蛹期6-7 d,蛹期(包括初蛹、中蛹和后蛹)5-6 d,雄峰一般要比雌蜂提前2 d羽化。2.通过解剖学观察和形态学鉴定,明确了荔枝蝽平腹小蜂的毒液器官为蜜蜂型,位于雌蜂腹部近背面,卵巢的下方。发现荔枝蝽平腹小蜂的雌蜂羽化后7d内,毒囊会随天数的增加而逐渐增大,在第7d体积达到最大。3.利用RNA-seq技术测定了荔枝蝽平腹小蜂的转录组文库(Anastatus sp),共获得89,698,356条clean reads。利用Trinity软件进行序列组装,共得到58160条Unigenes,总长度为51,712,053 nt,GC含量为32.3%,N50和平均长度分别为2113 nt和889 nt,最长的unigene长28184 nt,最短的201 nt。经由blast X比对,共注释到22044条Unigenes,共获得21698条氨基酸序列,并对注释到的Unigenes进行了同源性富集分析,与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)的同源性最高;利用ESTScan软件预测未注释的Unigenes的编码区域,得到了3175条氨基酸序列。4.本研究以荔枝蝽平腹小蜂的转录组为背景,利用Label-free蛋白质组学技术对雌蜂寄生前和寄生后的毒液进行蛋白质组学分析,共检测到2084个蛋白,鉴定了81个毒液蛋白组分,包括贮存蛋白(Hexamerin),几丁质酶2(Chitinase 2),钙网蛋白(Calreticulin),热休克蛋白83-样(Heat shock protein 83-like),丝氨酸蛋白酶(Serine protease),精氨酸激酶(Arginine kinase),磷酸丝氨酸转氨酶(Phosphoserine aminotransferase)和肌动蛋白(Actin)等。寄生前后毒液中共同鉴定到1628个蛋白,包括212个在寄生前后毒液内差异表达的蛋白,其中181个上调蛋白和31个下调蛋白。除此之外,筛选出了9个在寄生前毒液内特异性表达的蛋白;26个在寄生后毒液内特异性表达的蛋白。利用RT-q PCR技术对寄生前和寄生后的毒液蛋白差异,进行了m RNA水平的验证。5.通过解剖荔枝蝽(Tessaratoma papillosa)的卵发现,荔枝蝽平腹小蜂未将卵注射到荔枝蝽胚胎的血腔中,而是产于寄主的卵壳与胚胎的空隙内。基于本研究的结果,以及与其他寄生蜂毒液组分的对比,我们提出了一个关于荔枝蝽平腹小蜂寄生过程的假设模型:(1)荔枝蝽平腹小蜂产卵时,将卵和毒液一同注射到寄主的卵壳和胚胎之间的缝隙中。(2)毒液中的精氨酸激酶可迅速麻痹寄主,使其失去抵抗力。(3)毒液中一定量的贮存蛋白可使寄主发育停滞,进入滞育状态。(4)毒液中的几丁质酶加速免疫相关蛋白如钙网蛋白向寄主体内的扩散,抑制寄主的免疫应答。(5)各个毒液蛋白组分之间相互协作,在荔枝蝽平腹小蜂的卵未孵化时,创造了其安全的生境;待卵孵化后,保证了后代以寄主胚胎为食,导致寄主死亡,达到控制害虫的目的。综上所述,通过研究,我们明确了荔枝蝽平腹小蜂毒液器官为蜜蜂型;测定了荔枝蝽平腹小蜂转录组和荔枝蝽平腹小蜂雌蜂寄生前后毒液的蛋白质组学数据,利用RT-q PCR对其差异表达蛋白基因进行了初步分析。显微镜观察发现到雌蜂将卵注入到寄主卵壳与胚胎之间的缝隙中,而非寄主胚胎的血腔内。本研究的结果为进一步研究这些毒液蛋白的功能以及准确定位寄生过程中的关键蛋白提供依据。也为深入了解卵寄生蜂与寄主相互作用过程中毒液的演变开辟了道路,从而开发出新的生物防治策略。
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