宫颈癌是严重威胁女性健康的疾病之一,发病率仅次于乳腺癌,位于女性恶性肿瘤的第二。近年来随着人们思维方式和生活理念的变化,宫颈癌的发病率有明显上升趋势,发病年龄呈现年轻化。目前宫颈癌的病因尚未完全明了,与宫颈癌发病相关的因素很多,初次性交年龄过小、男或女方多个性伴侣、免疫力低下及宫颈慢性炎症等良性疾病被认为是宫颈癌的重要危险因素。其他如吸烟、口服避孕药、多孕多产、教育程度低、经济状况差和营养不良等也被认为是导致宫颈癌发生的关联因素。已有研究报道,肿瘤的发生发展与机体炎症感染密切相关,流行病学调查结果显示,90%以上的宫颈癌患者伴有人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)感染,在HPV病毒持续存在的情况下,多种因素的共同作用破坏了宫颈上皮细胞,并诱导机体免疫应答平衡失调。可以认为,高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是重要的危险因素之一,目前几乎所有的流行病学调查均显示高危型HPV感染,是宫颈癌及癌前病变发病的主要条件。宫颈癌患者机体内免疫微环境的变化也越来越受到重视。由于HPV感染所致宫颈病变直至发展为宫颈癌的自然史较长,在漫长的病程中,患者体内免疫功能状态如何?自身的免疫系统如何清除病毒感染等都有待研究。近些年关于肿瘤免疫的研究表明,肿瘤患者有着免疫调节异常所产生的免疫抑制状态,因此,深入研究宫颈癌患者的免疫抑制机制,探讨基于免疫调控的干预和寻找有效的治疗有着积极意义。近年来人们对CD4+T细胞抗肿瘤免疫的作用给予了很大的关注。在抗原的刺激下,CD4+T细胞亚群被诱导分化分为效应T细胞和调节性T细胞两类,效应T细胞因产生的细胞因子不同被分为若干亚群：Thl细胞,由IL-12诱导分化,产生主要的细胞因子是IFN—γ介导机体的细胞免疫；Th2细胞由IL-4诱导分化,主要产生IL-4、IL-5等细胞因子介导机体的体液免疫。此外,还有Th17细胞、Tfh细胞和Th9细胞等,其中产生IL-17的Thl7细胞与各种免疫炎症的发生密切相关,在各种变态反应和自身免疫性疾病中发挥重要作用。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群,在维持机体免疫稳定、调控免疫应答方面起重要的作用。Treg细胞的免疫无能和免疫抑制使得肿瘤免疫逃逸,进而导致机体对肿瘤的免疫无应答或免疫耐受。同时患者体内的肿瘤微环境能产生大量的特异性趋化因子,招募相应的免疫细胞到达肿瘤组织中,进而产生大量的细胞因子、生长因子、脂质信号等抑制机体的抗肿瘤免疫效应,增强肿瘤细胞的存活能力,促进肿瘤的生长。因此,肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的一个热点。CD4+T细胞各亚群功能状态在宫颈癌患者体内的平衡状况及与疾病预后的关系,目前研究较少。研究分析患者机体内环境中相关免疫细胞及有关的细胞因子和转录因子的变化以及可能机制,能为宫颈癌的临床监测和免疫治疗提供新的思路。1.研究目的(1)了解宫颈癌患者外周血和肿瘤组织中CD4+T细胞相关亚群的比例,分析其相关转录因子和细胞因子的表达水平,同时以Th17细胞为靶标,考察Th17细胞表面趋化因子受体及肿瘤组织中相应配体的表达情况,探讨Th17细胞与宫颈癌临床、病理分期的关系。(2)通过观察Th1/Th2细胞、Th17/Th1细胞、Th17/Treg细胞的平衡状态,初步了解宫颈癌患者机体的免疫微环境,为从免疫失衡调节的角度认识疾病发生发展的规律和寻找免疫干预途径奠定基础。(3)通过检测TLR7、TLR8和TLR9在宫颈癌的表达、分析TLR8的表达与Bcl-2、VEGF的相互关系,以便进一步探讨宫颈癌发生发展过程中TLR8与CD4+T细胞亚群平衡失调的关系及可能机制打下基础。2.研究方法(1)临床病例分组及标本采集。(2)用流式细胞术检测宫颈癌患者外周血及肿瘤组织中Th1、Th2比率。分离单个核细胞,经重悬然后加入刺激剂(佛波酯和离子霉素)刺激细胞,置37℃,5%C02培养箱,刺激培养5小时,流式细胞仪分析荧光抗体染色结果(抗人CD3-APC、抗人CD8-Percpcy5.5.抗人CD45-FITC等)；同时进行细胞内细胞因子分析。以CD3+CD8-IFN-γ+T和CD45+CD3+CD8-IFN-γ+T细胞分别表示外周血和组织中的Th1细胞比例,以CD3+CD8-IL-4+和CD45+CD3+CD8IL-4+T细胞分别表示外周血和组织中的Th2细胞比例。(3)检测Th17细胞在宫颈癌中的表达及其宫颈癌发病中的作用。免疫组化检测IL-17在早、晚期宫颈癌组织中的表达。流式细胞术检测宫颈癌患者外周血Th17细胞及Th17细胞表面趋化因子受体CCR5、CXCR4和CCR6的表达；QRT-PCR检测宫颈癌患者外周血中RORγt mRNA、IL-17 mRNA和肿瘤组织中趋化因子的表达水平：常规提取外周血和肿瘤组织中单个核细胞总RNA并逆转录为cDNA后,用实时定量PCR仪检测并计算表达量。(4)流式细胞术检测Treg细胞。完成单个核细胞膜表面和细胞内荧光抗体染色后,流式细胞仪分析,以CD4+FoxP3+和CD45+CD4+FoxP3+分别表示外周血、肿瘤组织中的Treg细胞比例。(5)免疫荧光法检测宫颈癌细胞系(Hela:细胞)TLR8的表达情况：加入TLR8特异性抗体,37℃孵育3h,加入Hochest33258染色,荧光显微镜观察。Real-timePCR检测宫颈癌患者TLR7、8、9及Bcl-2、VEGF mRNA表达水平。3.研究结果(1)宫颈癌患者外周血中Thl细胞水平明显降低,Th2细胞比率无显著性变化,外周血中Th1/Th2比值与对照组相比比值明显下降(P<0.05),肿瘤组织局部Th1/Th2比值与对照组相比未见明显差异(P>0.05)。(2)Th17细胞检测结果：1)免疫组化法检测IL-17在肿瘤组织中表达的结果显示,随着宫颈癌疾病的进展,IL-17在局部肿瘤组织中的表达水平呈上升趋势。2) QRT-PCR检测患者外周血中Th17细胞的特异性转录因子RORγt mRNA和主要细胞因子IL-17mRNA的表达水平,均显著高于健康对照(P<0.01,P<0.05),其中晚期宫颈癌患者比率最高,健康对照组最低,早期宫颈癌组介于两者之间。3)流式细胞术分析结果表明,患者外周血中Th17细胞(CD3+CD8-IL-17+T细胞)比率明显高于对照组(P<0.05)；同时,肿瘤组织中Th17细胞比率也显著高于对照组(P<0.05),患者外周血和局部肿瘤组织呈现Th17细胞的优势表达。4)Th17与Thl细胞的相关性分析,未发现宫颈癌患者外周血中两种细胞有明显的相关性,而在肿瘤发生发展的一定阶段,肿瘤组织中Th17细胞和Thl细胞间呈明显的负相关。5)Th17细胞表面趋化因子受体：患者肿瘤组织中CCR5、CXCR4的表达虽有变化,但无统计学意义,而CCR6表达显著升高。RT-PCR检测肿瘤组织中CCR5、CCR6、CXCR4相应配体的结果显示,CCR6的配体CCL20的mRNA表达明显增加,而RANTES、CXCL12的表达无显著差异。(3) Treg细胞的检测结果：1)宫颈癌患者外周血、肿瘤组织中的Treg细胞比例均高于健康对照组(P<0.01)。2)不同期别肿瘤中Th17/Treg比值随着宫颈癌病程进展有差异,晚期宫颈癌的Th17/Treg细胞比值显著低于早期宫颈癌(P<0.01)；相关性分析表明,Th17与Treg呈负相关(P<0.05)。(4)TLR8检测结果1) Real-timePCR检测结果显示,Hela细胞中呈现高TLR8mRNA转录水平；荧光抗体染色呈现相似的结果,表达率近100%,TLR8蛋白定位于Hela细胞的胞浆内。2)宫颈癌组织中TLR7、TLR8、Bcl-2和VEGF表达显著高于健康对照组(P<0.05),而TLR9的表达水平与健康对照组之间没有明显差异(P>0.05)。肿瘤组织中Bcl-2、VEGF与TLR8 mRNA水平的变化呈正相关,而与TLR7 mRNA无相关性。4.结论(1)宫颈癌患者外周血Thl细胞水平和Th1/Th2比值明显降低,表明Thl细胞介导的抗肿瘤效应受到抑制,与肿瘤的发生发展有着密切的关系。肿瘤组织中的Th1/Th2比值并未发现明显改变,提示机体整体免疫状态与癌症组织局部免疫微环境并非完全一致,可能与疾病发展的时空差异或免疫细胞的组织迁移能力相关。(2)免疫组化、QRT-PCR、流式细胞术等检测手段均显示,宫颈癌患者外周血和肿瘤组织中Th17细胞均明显增加,整体呈现Th17高表达状态,且随着病程的发展,Th17细胞呈继续升高趋势。同时患者癌组织中的Th17细胞显著增高,可能系Th17细胞高表达趋化因子受体CCR6,而在癌组织中存在高表达的CCR6配体CCL20之故。提示,宫颈癌患者Th17细胞倾向于向肿瘤组织中聚集,有可能成为构成宫颈癌晚期肿瘤微环境的特点之一。(3)宫颈癌患者Treg细胞水平增加,且在宫颈癌后期,随着Treg细胞水平的升高Th17/Treg细胞的比值显著降低,两者呈明显负相关。Th17/Treg细胞比值可作为临床监测宫颈癌病情及判断预后的免疫指标。(4)分析了宫颈癌细胞表面的Toll样受体。结果表明,肿瘤细胞表达TLR8,尤以宫颈癌Hela细胞系为著,宫颈癌患者组织中TLR7、TLR8表达显著增高且肿瘤组织中Bcl-2、VEGF的升高与TLR8 mRNA水平的变化呈正相关。提示TLR8的表达与宫颈癌的发生发展可能存在着一定的关系。这对从HPV感染到宫颈癌的发生发展提供了全面认识的节点,也为进一步探讨宫颈癌发生发展过程中TLR8与CD4+T细胞亚群平衡失调的关系及可能机制提供了基础。