黑寡妇蜘蛛(L.tredectimguttatus)毒素分布的一个显著特点是毒腺外(如卵粒中)也存在毒素。目前一般认为卵粒毒素存在的意义在于保护卵粒免遭某些贪食动物和病原微生物的侵袭,从而提升蜘蛛物种的存活机率和进化优势。包括蛋白质组学分析在内的一系列研究证明卵粒和毒腺毒性的分子基础存在很大差异,提示很有可能从卵粒中发现可以用作工具试剂和1临床药物开发的新型毒素和其他生物活性分子。目前,获取目标毒素或其他活性成分最常用的方法是先从天然材料中提取,然后再进行活性筛选。然而这种方法通常具有高成本、低产量以及周期长等局限性,在天然材料来源有限、材料成分复杂和目标产物丰度低时尤其是这样。基于分子生物学技术的异源表达为筛选蛋白质类生物活性成分提供了另一条不依赖于天然提取的有效途径,前提是它们的全长基因已知。由于第二代RNA测序技术的发展,使高效率、低成本的转录组测序成为可能,从而可以获得许多关于编码蛋白质和多肽的全长基因序列,包括那些由于表达丰度低而无法从天然材料中直接提取的蛋白质和多肽的基因序列,从而为不依赖于天然提取的蛋白质和多肽基因的克隆、异源表达和活性筛选提供了方便。在我们的前期工作中,我们测定了黑寡妇蜘蛛卵粒的转录组,获得了 14185个unigene,发现其中280个unigene编码的蛋白质或多肽与已知的毒素具有同源性。本研究从中选择了一个unigene序列进行克隆、异源表达和活性筛选以达到不依赖天然提取而获得毒素的目的。选择的该基因能编码一个具有ICK(inhibitor cystine knot)模体的多肽,而ICK模体是许多多肽类神经毒素共有的结构特征。我们首先从蜘蛛卵粒中提取总RNA,然后通过逆转录构建相应的cDNA文库。利用3’ RACE结合巢式PCR技术扩增出目标DNA序列后将PCR产物连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。然后利用带特殊修饰的一对表达引物从重组T-载体中扩增出全部编码序列并将其克隆入表达载体pET32a。在27℃条件下利用0.5mM IPTG成功实现了蛋白质的诱导表达。利用Ni-NTA琼脂糖珠的亲和纯化优势顺利地获得了电泳纯的融合蛋白。为了得到纯化的目的多肽,利用重组的牛肠激酶裂解融合蛋白并用RP-HPLC对裂解产物进行分离。电喷雾质谱分析表明,纯化多肽的单同位素分子量为6195.61 Da,而该多肽还原状态下的单同位素分子量为6205.67 Da,提示该多肽分子中的10个Cys残基形成了 5对二硫键。膜片钳实验证明,2 μM浓度的该多肽能抑制ND 7/23细胞膜上约37%的钠离子通道电流,但是,即使是用10μM浓度的该多肽处理美洲蜚蠊DUM神经细胞,也未见对其钠离子通道电流产生影响。所以,该多肽是一种能特异性作用于哺乳动物神经细胞膜钠离子通道的神经毒素。根据其在黑寡妇蜘蛛卵粒中被发现和研究的顺序命名为Latroeggtoxin-Ⅵ。本研究不仅为该多肽毒素进一步的结构-功能关系和可能的开发应用研究奠定了基础,而且也为不依赖于天然提取的蛋白质类活性成分的筛选提供了可以借鉴的方法。