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本研究主要关注同LIRI关系较为密切的肺毛细血管中的内皮细胞，探讨propofol对肺微血管内皮细胞（PMVEC）的保护作用，以及相关于PKC-Nrf2通路的机制研究。
第一部分 肺微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤模型的建立
研究目的:
该部分主要对大鼠肺部的MVEC进行分离、原代培养和传代培养，并且鉴定其性状，以及建立可用于实验检测用的，可稳定重复的缺氧-复氧损伤的PMVEC模型，为异丙酚的保护作用和保护机制的研究提供实验工具。
研究方法:
1、PMVEC的分离和原代培养：
2、PMVEC形态观察和特异性标记物Ⅷ因子表达鉴定：
3、细胞缺氧-复氧模型参数确立
4、MTT法测定上述各组PMVEC的增殖情况。
研究结果:
1、PMVEC形态观察：
第3代PMVEC形态表现为多角形形状，成铺路石状镶嵌排列，单层生长，几乎无多层生长，是典型的内皮细胞形态。
经Ⅷ因子表达鉴定后，显示95%细胞以上均为Ⅷ因子阳性。
2、缺氧-复氧条件确定：
在无多聚赖氨酸包被情况下，同对照组相比，缺氧3小时，6小时和9小时组的细胞成活率无统计学差异；缺氧12小时，细胞存活率是对照组的（48.7%±15.4%），统计学差异显著（P＜0.05）；当缺氧24小时后，细胞几乎全部死亡（P＜0.05），存活率仅为（9.2%±11.7%）
经多聚赖氨酸包被培养皿后，经剥夺氧气9h和12h，细胞成活率分别为（70.2%±19.7%）和（23.2%±12.5%），有统计学差异（P＜0.05）；缺氧24小时后，细胞几乎全部死亡（P＜0.05）。
研究结论:
1、成功分离和培养了原代PMVEC，具有典型的内皮细胞形态，表达Ⅷ因子蛋白。
2、PMVEC的缺氧-复氧条件为缺氧12小时，然后复氧24小时。
3、同无包被组相比，多聚赖氨酸包被不能明显改善缺氧-复氧对PMVEC存活率的影响。
第二部分 异丙酚对肺微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤模型的保护效果
研究目的:
本部分研究主要探讨了异丙酚对于PMVEC的保护作用，着重从异丙酚对PMVEC在对抗缺氧-复氧损伤带来的氧化效应、增殖损伤、细胞凋亡和细胞周期等方面进行较为全面的探讨。
研究方法:
1、检测异丙酚对大鼠PMVEC的剂量-毒性效应
2、细胞分组
3、CCK-8测定Propofol增殖保护的剂量依赖作用。
4、比色法测定上清液MDA浓度。
5、测定上清液中SOD酶活性。
6、PI-Annexin V染色测定异丙酚对缺氧-复氧导致大鼠PMVEC凋亡的保护作用。
7、PI染色测定异丙酚对缺氧-复氧改变大鼠PMVEC周期的影响。
研究结果:
1、异丙酚显示出对大鼠正常PMVEC的低毒性特性。
异丙酚浓度为375ug/mL~2500ug/mL时，细胞死亡率较少（P＞0.05）；当异丙酚浓度高达5000ug/mL、10000ug/mL时，PMVEC的死亡明显增加（P＜0.05）；说明异丙酚仅在高剂量时才显示出毒性，本研究中选择的浓度均低于2500ug/mL。
2、异丙酚对缺氧-复氧损伤的大鼠PMVEC增殖能力的保护作用
同正常PMVEC相比，缺氧-复氧处理抑制PMVEC增殖（P＜0.05）；62.5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对缺氧-复氧损伤具有防护作用，具有明显高于损伤组的吸光度值（P＜0.05）。
3、异丙酚减少了缺氧-复氧所导致的大鼠PMVEC高分泌的MDA
缺氧-复氧PMVEC分泌MDA的水平明显高于正常PMVEC（P＜0.05）；异丙酚浓度为125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL时处理的PMVEC分泌的MDA水平明显低于缺氧-复氧PMVEC（P＜0.05）。
4、异丙酚减弱缺氧-复氧损伤大鼠PMVEC低水平分泌SOD的损害作用
同正常PMVEC相比较，缺氧-复氧处理下调了PMVEC分泌SOD的能力，SOD水平低于正常PMVEC（P＜0.05）；62.5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对内皮细胞分泌SOD具有升高作用，差异显著（P＜0.05）。
5、异丙酚降低缺氧-复氧损伤所致的大鼠PMVEC的凋亡
正常细胞凋亡很低，缺氧-复氧处理导致了大鼠PMVEC的凋亡，从（2.1±1.8）%上升至（32.1±4.8）%，明显高于正常对照组细胞（P＜0.05）；而125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对于大鼠PMVEC具有保护作用，明显下降了缺氧-复氧所致的细胞凋亡（P＜0.05）。
6、异丙酚对大鼠缺氧-复氧PMVEC的细胞周期影响
缺氧-复氧下调了大鼠PMVEC的S期细胞比例，从正常PMVEC的（47.6±8.4）%下降为（21.9±4.5）%（P＜0.05）；62ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚显著影响缺氧-复氧处理的PMVEC的细胞周期分布，表现为同损伤组相比，分布于S期的PMVEC比例依次升高（P＜0.05）；但对G1期、G2期细胞比例未见明显影响
研究结论:
1、异丙酚仅在高剂量时才显示出对正常PMVEC的毒性。
2、缺氧复氧是造成PMVEC损伤的原因，损伤的表现为抑制细胞增殖，提高细胞凋亡，减少DNA合成期细胞，造成氧化应激，增加脂质过氧化物MDA水平，下调自由基清除酶SOD水平。
3、异丙酚具有保护PMVEC的缺氧复氧损伤的作用，表现为恢复细胞增殖，减少细胞凋亡，增加DNA合成期细胞数量，减轻氧化应激水平，减少脂质过氧化物MDA水平，上调自由基清除酶SOD水平。
第三部分 异丙酚对肺微血管内皮细胞缺氧复氧损伤模型的保护机制研究
研究目的:
本研究中，我们拟使用异丙酚预处理，及PKC基因敲减或Nrf2基因敲减，共同作用于PMVEC，检测异丙酚是否可激发PMVEC胞内的HO-1提高，并且该进程是否由PKC-Nrf2通路介导。
研究方法:
1、构建具有对PKC或Nrf2基因进行敲减作用的shRNA慢病毒，并感染PMVEC，并采用实时荧光定量PCR法和免疫蛋白印迹法检测基因敲减效果。
2、细胞分组
3、CCK-8测定PKC或Nrf2基因敲减对异丙酚保护大鼠PMVEC的增殖影响
4、比色法测定上清液中MDA浓度，观察PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚下降内皮细胞上清中MDA水平的干扰能力。
5、测定细胞上清液中SOD酶活力，观察PKC基因敲减或Nrf2基因敲减干扰异丙酚的抗氧化能力。
6、PI-Annexin V染色测定PKC或Nrf2基因敲减对异丙酚防治细胞凋亡的干扰。
7、免疫蛋白印迹法检测HO-1水平变化，检测PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚保护细胞免于缺氧-复氧损伤中HO-1水平的影响
研究结果:
1、成功构建了具有PKC或Nrf2基因敲减作用的shRNA慢病毒，滴度分别为5×109TU/ml和5×108TU/ml，均能显著抑制PMVEC中对应基因的mRNA和蛋白水平；
2、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减抑制了异丙酚对缺氧-复氧损伤的大鼠PMVEC的增殖保护作用：
3、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚下降内皮细胞上清中MDA水平具有抑制作用：
4、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减减弱了异丙酚上调PMVEC上清中SOD水平的能力：
SOD水平是体现细胞清除氧自由基能力的重要参数，异丙酚可以提高PMVEC中的SOD水平，提高对氧自由基的清除能力，然而PKC基因或者Nrf2基因的抑制，下调了异丙酚提高细胞清除氧自由基的能力，表现为SOD水平显著降低（P＜0.05），且Nrf2敲减组SOD水平几乎同缺氧-复氧损伤组相似。
5、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减降低了异丙酚对细胞凋亡的抵抗作用：
异丙酚对缺氧-复氧所导致的细胞凋亡具有抵抗作用，然而PKC基因或者Nrf2基因敲减后，异丙酚的这种抵抗细胞凋亡的作用出现了明显的下降，尤其是Nrf2敲减组，细胞凋亡水平同缺氧-复氧损伤组无统计学差异（P＜0.05）。
6、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减抑制了异丙酚对细胞HO-1蛋白水平的上调：缺氧-复氧处理导致了细胞HO-1蛋白水平代偿上调，异丙酚可以进一步增强
这种代偿作用，HO-1蛋白水平较缺氧-复氧损伤组明显增加，然而，PKC基因或者Nrf2基因敲减后，异丙酚的这种增强作用出现降低，HO-1蛋白水平下降明显（P＜0.05）。
研究结论:
1、PKC敲低和NRF2敲低均可以抑制异丙酚的保护作用，包括抑制增殖、增加凋亡，增加MDA和下调SOD；与此同时，HO-1水平明显降低。
2、PKC/NRF2/HO-1通路是异丙酚保护缺氧复氧损伤PMVEC的机制之一。
第一部分 肺微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤模型的建立
研究目的:
该部分主要对大鼠肺部的MVEC进行分离、原代培养和传代培养，并且鉴定其性状，以及建立可用于实验检测用的，可稳定重复的缺氧-复氧损伤的PMVEC模型，为异丙酚的保护作用和保护机制的研究提供实验工具。
研究方法:
1、PMVEC的分离和原代培养：
2、PMVEC形态观察和特异性标记物Ⅷ因子表达鉴定：
3、细胞缺氧-复氧模型参数确立
4、MTT法测定上述各组PMVEC的增殖情况。
研究结果:
1、PMVEC形态观察：
第3代PMVEC形态表现为多角形形状，成铺路石状镶嵌排列，单层生长，几乎无多层生长，是典型的内皮细胞形态。
经Ⅷ因子表达鉴定后，显示95%细胞以上均为Ⅷ因子阳性。
2、缺氧-复氧条件确定：
在无多聚赖氨酸包被情况下，同对照组相比，缺氧3小时，6小时和9小时组的细胞成活率无统计学差异；缺氧12小时，细胞存活率是对照组的（48.7%±15.4%），统计学差异显著（P＜0.05）；当缺氧24小时后，细胞几乎全部死亡（P＜0.05），存活率仅为（9.2%±11.7%）
经多聚赖氨酸包被培养皿后，经剥夺氧气9h和12h，细胞成活率分别为（70.2%±19.7%）和（23.2%±12.5%），有统计学差异（P＜0.05）；缺氧24小时后，细胞几乎全部死亡（P＜0.05）。
研究结论:
1、成功分离和培养了原代PMVEC，具有典型的内皮细胞形态，表达Ⅷ因子蛋白。
2、PMVEC的缺氧-复氧条件为缺氧12小时，然后复氧24小时。
3、同无包被组相比，多聚赖氨酸包被不能明显改善缺氧-复氧对PMVEC存活率的影响。
第二部分 异丙酚对肺微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤模型的保护效果
研究目的:
本部分研究主要探讨了异丙酚对于PMVEC的保护作用，着重从异丙酚对PMVEC在对抗缺氧-复氧损伤带来的氧化效应、增殖损伤、细胞凋亡和细胞周期等方面进行较为全面的探讨。
研究方法:
1、检测异丙酚对大鼠PMVEC的剂量-毒性效应
2、细胞分组
3、CCK-8测定Propofol增殖保护的剂量依赖作用。
4、比色法测定上清液MDA浓度。
5、测定上清液中SOD酶活性。
6、PI-Annexin V染色测定异丙酚对缺氧-复氧导致大鼠PMVEC凋亡的保护作用。
7、PI染色测定异丙酚对缺氧-复氧改变大鼠PMVEC周期的影响。
研究结果:
1、异丙酚显示出对大鼠正常PMVEC的低毒性特性。
异丙酚浓度为375ug/mL~2500ug/mL时，细胞死亡率较少（P＞0.05）；当异丙酚浓度高达5000ug/mL、10000ug/mL时，PMVEC的死亡明显增加（P＜0.05）；说明异丙酚仅在高剂量时才显示出毒性，本研究中选择的浓度均低于2500ug/mL。
2、异丙酚对缺氧-复氧损伤的大鼠PMVEC增殖能力的保护作用
同正常PMVEC相比，缺氧-复氧处理抑制PMVEC增殖（P＜0.05）；62.5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对缺氧-复氧损伤具有防护作用，具有明显高于损伤组的吸光度值（P＜0.05）。
3、异丙酚减少了缺氧-复氧所导致的大鼠PMVEC高分泌的MDA
缺氧-复氧PMVEC分泌MDA的水平明显高于正常PMVEC（P＜0.05）；异丙酚浓度为125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL时处理的PMVEC分泌的MDA水平明显低于缺氧-复氧PMVEC（P＜0.05）。
4、异丙酚减弱缺氧-复氧损伤大鼠PMVEC低水平分泌SOD的损害作用
同正常PMVEC相比较，缺氧-复氧处理下调了PMVEC分泌SOD的能力，SOD水平低于正常PMVEC（P＜0.05）；62.5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对内皮细胞分泌SOD具有升高作用，差异显著（P＜0.05）。
5、异丙酚降低缺氧-复氧损伤所致的大鼠PMVEC的凋亡
正常细胞凋亡很低，缺氧-复氧处理导致了大鼠PMVEC的凋亡，从（2.1±1.8）%上升至（32.1±4.8）%，明显高于正常对照组细胞（P＜0.05）；而125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚对于大鼠PMVEC具有保护作用，明显下降了缺氧-复氧所致的细胞凋亡（P＜0.05）。
6、异丙酚对大鼠缺氧-复氧PMVEC的细胞周期影响
缺氧-复氧下调了大鼠PMVEC的S期细胞比例，从正常PMVEC的（47.6±8.4）%下降为（21.9±4.5）%（P＜0.05）；62ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL浓度的异丙酚显著影响缺氧-复氧处理的PMVEC的细胞周期分布，表现为同损伤组相比，分布于S期的PMVEC比例依次升高（P＜0.05）；但对G1期、G2期细胞比例未见明显影响
研究结论:
1、异丙酚仅在高剂量时才显示出对正常PMVEC的毒性。
2、缺氧复氧是造成PMVEC损伤的原因，损伤的表现为抑制细胞增殖，提高细胞凋亡，减少DNA合成期细胞，造成氧化应激，增加脂质过氧化物MDA水平，下调自由基清除酶SOD水平。
3、异丙酚具有保护PMVEC的缺氧复氧损伤的作用，表现为恢复细胞增殖，减少细胞凋亡，增加DNA合成期细胞数量，减轻氧化应激水平，减少脂质过氧化物MDA水平，上调自由基清除酶SOD水平。
第三部分 异丙酚对肺微血管内皮细胞缺氧复氧损伤模型的保护机制研究
研究目的:
本研究中，我们拟使用异丙酚预处理，及PKC基因敲减或Nrf2基因敲减，共同作用于PMVEC，检测异丙酚是否可激发PMVEC胞内的HO-1提高，并且该进程是否由PKC-Nrf2通路介导。
研究方法:
1、构建具有对PKC或Nrf2基因进行敲减作用的shRNA慢病毒，并感染PMVEC，并采用实时荧光定量PCR法和免疫蛋白印迹法检测基因敲减效果。
2、细胞分组
3、CCK-8测定PKC或Nrf2基因敲减对异丙酚保护大鼠PMVEC的增殖影响
4、比色法测定上清液中MDA浓度，观察PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚下降内皮细胞上清中MDA水平的干扰能力。
5、测定细胞上清液中SOD酶活力，观察PKC基因敲减或Nrf2基因敲减干扰异丙酚的抗氧化能力。
6、PI-Annexin V染色测定PKC或Nrf2基因敲减对异丙酚防治细胞凋亡的干扰。
7、免疫蛋白印迹法检测HO-1水平变化，检测PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚保护细胞免于缺氧-复氧损伤中HO-1水平的影响
研究结果:
1、成功构建了具有PKC或Nrf2基因敲减作用的shRNA慢病毒，滴度分别为5×109TU/ml和5×108TU/ml，均能显著抑制PMVEC中对应基因的mRNA和蛋白水平；
2、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减抑制了异丙酚对缺氧-复氧损伤的大鼠PMVEC的增殖保护作用：
3、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减对异丙酚下降内皮细胞上清中MDA水平具有抑制作用：
4、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减减弱了异丙酚上调PMVEC上清中SOD水平的能力：
SOD水平是体现细胞清除氧自由基能力的重要参数，异丙酚可以提高PMVEC中的SOD水平，提高对氧自由基的清除能力，然而PKC基因或者Nrf2基因的抑制，下调了异丙酚提高细胞清除氧自由基的能力，表现为SOD水平显著降低（P＜0.05），且Nrf2敲减组SOD水平几乎同缺氧-复氧损伤组相似。
5、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减降低了异丙酚对细胞凋亡的抵抗作用：
异丙酚对缺氧-复氧所导致的细胞凋亡具有抵抗作用，然而PKC基因或者Nrf2基因敲减后，异丙酚的这种抵抗细胞凋亡的作用出现了明显的下降，尤其是Nrf2敲减组，细胞凋亡水平同缺氧-复氧损伤组无统计学差异（P＜0.05）。
6、PKC基因敲减或Nrf2基因敲减抑制了异丙酚对细胞HO-1蛋白水平的上调：缺氧-复氧处理导致了细胞HO-1蛋白水平代偿上调，异丙酚可以进一步增强
这种代偿作用，HO-1蛋白水平较缺氧-复氧损伤组明显增加，然而，PKC基因或者Nrf2基因敲减后，异丙酚的这种增强作用出现降低，HO-1蛋白水平下降明显（P＜0.05）。
研究结论:
1、PKC敲低和NRF2敲低均可以抑制异丙酚的保护作用，包括抑制增殖、增加凋亡，增加MDA和下调SOD；与此同时，HO-1水平明显降低。
2、PKC/NRF2/HO-1通路是异丙酚保护缺氧复氧损伤PMVEC的机制之一。