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伪狂犬病(Pseudoeabies,PRV)又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ(suiderpesvirusⅠ)所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。尤其是猪伪狂犬病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。伪狂犬病毒基因组全长约150kb,可编码70～100种蛋白,与α-疱疹病毒亚科的其它成员一样,PRV具有潜伏感染和神经嗜性等α-疱疹病毒的典型特征。长期以来,基因缺失突变株的构建是研究疱疹病毒功能基因的主要策略,但在哺乳动物细胞中通过同源重组的方法构建基因缺失突变株是一项极为繁琐的工作。1997年,德国学者Messerle等首次以细菌人工染色体(Bacterial ArtificialChromosomes,BAC)为基础构建了鼠巨细胞病毒的感染性克隆。该技术允许病毒基因组以BAC质粒的形式在大肠杆菌中保存、增殖和遗传修饰,并且操作简便、快速,极大地促进了疱疹病毒的功能基因研究,并为疱疹病毒高效载体系统的开发提供了新的途径。本研究通过基因克隆技术以PRV弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源臂,以及绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记构建了带loxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,然后将pBeloBAC11线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BAC11。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。