抗体类药物是指含有抗体功能区的蛋白药物,其中肽体在生物医学研究及应用领域取得了显著成效。肽体是将具有生物活性的多肽与IgG的铰链区和Fc片段进行基因重组而表达的融合蛋白。因此肽体不仅呈现出所融合多肽的生物学活性,而且还具有IgG-Fc段的功能特点,包括显著延长其血浆半衰期以及结合、活化巨噬细胞、NK细胞等固有免疫细胞发挥免疫效应等。自从1989年第一个功能性IgG-Fc融合蛋白-CD4-Fc问世以来,几种应用于不同领域的治疗性肽体已成功进入市场由于融合了具有生物学功能的多肽以及IgG抗体的Fc区,因此肽体具有增强稳定性、亲和力、便于纯化、发挥ADCC/CDC作用等优势。本实验室前期利用噬菌体展示技术筛选获得了乳腺癌专一脑转移细胞系靶向结合多肽BRBP1,并分别在细胞与组织水平证实其具有高结合特异性。BRBP1肽可以与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合。综合肽体与BRBP1肽的优势,前期我们利用哺乳动物细胞表达系统通过瞬时转染表达了BRBP1-Fc肽体,但此种表达方式存在不足,BRBP1-Fc肽体的生物学功能并未达到预期。因此,本课题的主要研究内容如下:1.哺乳动物细胞表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定目的:本实验室前期利用哺乳动物细胞表达系统瞬时转染的方法成功表达了的BRBP1-Fc肽体并进行了结合能力验证。此方法表达的肽体得率、纯度及稳定性均存在不足,导致其结合能力不佳。通过哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有糖基化修饰位点,肽体的Fc段可发挥ADCC/CDC等治疗作用,因此本章我们继续选择哺乳动物细胞表达系统利用构建稳转细胞系的方法表达BRBP1-Fc肽体,提高其得率、纯度及表达稳定性,并对其结合231-BR细胞的能力进行鉴定。方法:将前期构建的pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1真核表达载体经单酶切回收、测序分析后转染至工具细胞CHO中,在初步验证转染成功后利用博来霉素加压筛选约二十天,利用有限稀释法或极限稀释法获得单克隆细胞。Western blot鉴定单克隆细胞BRBP1-Fc肽体表达情况。提取阳性单克隆细胞胞内DNA进行PCR扩增并送测序分析pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1是否正确整合至宿主基因组中,最终获得稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1的CHO细胞。选取表达量最高的一株进行扩大培养,收集细胞培养上清浓缩,利用Protien G柱纯化,获得BRBP1-Fc肽体。利用细胞ELISA与流式细胞术验证BRBP1-Fc肽体与231-BR细胞结合特异性。结果:经过Western blot、PCR扩增、测序鉴定后,我们共获得五株稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1 CHO细胞,其中4号细胞表达量最高。因此我们选取了4号细胞进行贴壁扩大培养,最终获得总量约0.64mg的BRBP1-Fc肽体。细胞ELISA与流式细胞术的结果显示,通过构建稳转细胞系所表达的BRBP1-Fc肽体尽管保留了BRBP1肽的结合特性,其结合231-BR细胞的能力不及前期荧光肽的结果。结论:成功构建了稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1 CHO细胞系并表达了总量约为0.64mg且纯度尚可的BRBP1-Fc肽体。在保证各实验条件合理的情况下,BRBP1-Fc肽体与231-BR细胞的结合能力不及前期荧光肽的结果。因此,后续需要针对BRBP1-Fc肽体的空间构象进行优化与改造。2、大肠杆菌表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定目的:相关文献提示,Fc融合蛋白中多肽与Fc段之间linker的长度影响其亲和力,因此我们探究延长BRBP1与Fc之间的linker长度,表达分别带有两组与三组重复linker(GGGGS)的BRBP1-Fc肽体以解决其结合能力不佳的问题。已知人IgG1较其他亚型相比应用价值更高,我们转换策略选择人IgG1的Fc段作为肽体的组成部分。由于本研究旨在探究BRBP1-Fc肽体在临床标本检测中的应用,不涉及其治疗应用,并且前期结果表明非糖基化不影响BRBP1的结合能力,因此我们利用无糖基化修饰但产量高、耗时短的大肠杆菌表达系统进行肽体的表达并验证其生物学功能。方法:为获取构建肽体所必需的人IgG1的Fc段,首先构建pFUSE-hIgG1-Fc2-BRBP1-Fc真核表达载体,随后利用PCR反应以该真核表达载体为模板扩增BRBP1-Fc片段,最后将其与pET-16b原核表达载体连接,构建pET-16b-BRBP1-Fc(L2)、pET-16b-BRBP1-Fc(L3)原核表达载体。随后将各载体转化至表达菌株中,并利用诱导剂IPTG诱导表达,Protien G柱纯化肽体,最后选择流式细胞术再次验证经改造后的带有不同长度linker的BRBP1-Fc肽体的生物学特性。结果:成功构建了pET-16b-BRBP1-Fc(L2)、pET-16b-BRBP1-Fc(L3)原核表达载体,经诱导表达、Protien G纯化后获得了浓度约为200μg/mL的BRBP1-Fc(L2)、BRBP1-Fc(L3)肽体。通过流式细胞术的检测,BRBP1-Fc(L2)、BRBP1-Fc(L3)肽体均显示出了与231-BR细胞的较高结合能力,其结合率分别达到了64%与87%。竞争抑制试验的结果同样表明随着linker长度增加,BRBP1-Fc肽体的亲和力也逐步增强。结论:通过改造成功得到了结合能力与亲和力均提高的BRBP1-Fc(L3)肽体,为下一步BRBP1-Fc肽体的临床应用奠定了重要的基础。3、BRBP1-Fc肽体与人乳腺癌病理组织结合性能鉴定目的:本实验室前期实验结果显示,BRBP1肽可与人部分乳腺浸润性导管癌石蜡组织标本特异性结合,具有临床应用潜能。本章中我们选择了BRBP1-Fc(L3)来验证其与人乳腺癌病理组织标本的结合特异性以探究BRBP1-Fc(L3)临床应用的潜能。方法:收集东南大学附属中大医院2013~2014年乳腺浸润性导管癌手术切除组织石蜡包埋标本27例,经脱蜡、抗原修复后孵育BRBP1-Fc(L3)肽体、Fc对照,洗涤后孵育HRP标记的兔抗人IgG抗体,经DAB法显色后观察BRBP1-Fc(L3)肽体结合情况。结果:BRBP1-Fc(L3)肽体可与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合,而对照Fc蛋白不与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞结合,说明BRBP1-Fc(L3)肽体与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合。并且在收集到的部分病例中,BRBP1-Fc(L3)肽体与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合的同时,与淋巴结转移灶肿瘤细胞同样结合。结论:与本实验室前期结果类似,BRBP1-Fc(L3)肽体在结合人乳腺癌原发灶肿瘤细胞的同时也与淋巴结转移灶肿瘤细胞结合。由于肽体比多肽稳定性更强、检测方法更实用于临床,因此可在条件优化后扩大临床样本量进一步探究BRBP1-Fc(L3)临床应用的潜能。综上所述,本研究成功利用大肠杆菌表达系统表达、纯化出与乳腺癌脑转移细胞系231-BR细胞结合能力较强的BRBP1-Fc(L3)肽体。初步的临床病理组织样本检测结果发现BRBP1-Fc(L3)肽体在结合人乳腺癌原发灶肿瘤细胞的同时也与淋巴结转移灶肿瘤细胞结合。本研究为BRBP1-Fc(L3)肽体的表达与应用奠定了重要的实验基础。