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目的:在我国膀胱癌的发病率一直居于泌尿系统肿瘤的首位,传统的治疗手段因其肿瘤杀伤能力低和副作用大等缺点,故而治疗效果远未令人满意。选择复制性溶瘤腺病毒治疗肿瘤是极其有前途的基因治疗肿瘤的方法。为此,本课题组构建了膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,在膀胱癌特异性启动子UPII和增强子PSCAE的控制下,该腺病毒能够选择性的在膀胱癌细胞中进行复制,从而发挥裂解肿瘤细胞的效应。前期的研究证实,我们所构建的腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,特异性高,其只在膀胱癌细胞中进行复制,对于膀胱癌细胞也有一定的杀伤作用。但UPII启动子的活性相对较低,往往会削弱腺病毒的复制,从而影响其肿瘤杀伤效应。p21/Waf1做为一个经典的细胞周期抑制蛋白,近年来确由于在腺病毒介导的基因治疗中的拮抗作用而受到广泛关注,但p21/Waf1对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的作用却不得而知。因此,本研究构建了p21/Waf1shRNA的慢病毒表达载体,并建立了稳定转染p21/Waf1 shRNA的人膀胱癌细胞株EJ和5637,检测p21/Waf1对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的肿瘤杀伤效应、病毒复制、UPII启动子的活性及诱导细胞发生凋亡的影响,并初步探讨了可能的作用机制,为p21/Waf1能否作为膀胱癌基因治疗的一个新靶点提供理论和实验依据。方法:(1)构建人p21/Waf1的慢病毒干扰载体。设计针对p21/Waf1 shRNA的序列,插入含GFP的pMagic 7.1载体,通过PCR和DNA测序技术对重组克隆进行鉴定,将重组病毒质粒和辅助包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并对病毒滴度进行检测。将表达p21/Waf1 shRNA的慢病毒转染EJ和5637细胞,以嘌呤霉素进行筛选,直到获得稳定转入p21/Waf1 shRNA的EJ和5637细胞,检测稳转细胞中p21/Waf1的表达。(2)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A肿瘤杀伤效应的影响。应用MTT比色法检测p21/Waf1敲减后腺病毒对人膀胱癌细胞株EJ和5637体外增殖效应的影响。(3)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A滴度的影响。利用腺病毒滴度快速检测法检测p21/Waf1敲减后腺病毒滴度的变化;检测与病毒复制密切相关的指标E1A和hexon的表达。(4)p21/Waf1对UPII启动子活性的影响。首先检测p21/Waf1对EJ和5637细胞中AR表达水平的影响;接下来利用脂质体转染的方法将携带荧光素酶报告基因的重组质粒Rp-PSCAE-UPII-Luc分别转染EJ和5637细胞,以pCMV-β-gal作为内对照,荧光素酶报告系统检测p21/Waf1敲减后UPII启动子活性的变化。(5)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A诱导凋亡的影响。利用流式细胞仪检测p21/Waf1敲减后Ad/PSCAE/UPII/E1A对EJ和5637凋亡的影响,分析凋亡信号转导通路相关因子的表达。结果:(1)成功构建了表达p21/Waf1 shRNA的重组慢病毒载体,获得滴度为4.12×108Tu/ml的慢病毒。(2)慢病毒的转染效率均>90%,获得稳定转染p21/Waf1 shRNA的EJ和5637细胞,p21/Waf1 shRNA能显著降低EJ和5637细胞中p21/Waf1的表达。(3)Ad/PSCAE/UPII/E1A对p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞增殖的抑制效应明显增强。(4)p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中腺病毒的滴度显著增强。(5)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中,腺病毒复制的相关指标E1A和hexon的表达明显上调。(6)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中AR的表达明显上调;荧光素酶活性检测显示,p21/Waf1敲减后的细胞内Luc的活性显著增强。(7)Ad/PSCAE/UPII/E1A均能诱导EJ和5637细胞发生凋亡,p21/Waf1敲减后的细胞凋亡显著增加。(8)Ad/PSCAE/UPII/E1A可以通过上调Fas、Bax、caspase 3、caspase 8的表达,下调Bcl-2的表达促进EJ和5637细胞发生凋亡;但EJ和5637的野生型细胞和p21/Waf1敲减的细胞相比时,在p21/Waf1敲减组中,Fas、caspase 3、caspase 8的表达上调,而Bax和Bcl-2的表达与野生型细胞相比无明显变化。结论:(1)成功构建了表达p21/Waf1 shRNA的重组慢病毒,且能有效感染膀胱癌细胞EJ和5637。(2)慢病毒介导的p21/Waf1 shRNA能显著降低EJ和5637细胞中p21/Waf1的表达。(3)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中,Ad/PSCAE/UPII/E1A的肿瘤杀伤效应显著增强。(4)在EJ和5637细胞中,敲减p21/Waf1可以增强UPII启动子的活性。(5)在EJ和5637中,敲减p21/Waf1能够通过增强腺病毒复制及诱导细胞凋亡增加从而使Ad/PSCAE/UPII/E1A的肿瘤杀伤显著增强。