【摘 要】
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目的:结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,好发生于结直肠的位置,其发病率与患者基因遗传易感、环境影响紧密相关。目前,手术、放化疗被广泛用于结直肠癌的治疗,然而治疗期间,肿瘤细胞对放化疗产生抵抗耐受,残癌细胞无疑成为治疗的重大阻碍。因此,探究潜在耐放化疗的分子机制,开发靶向药物至关重要。微RNAs（microRNAs）是一种单链RNA分子,由约20个核苷酸组成,miRNA异常表达,可下游调控靶基因异
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目的:结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,好发生于结直肠的位置,其发病率与患者基因遗传易感、环境影响紧密相关。目前,手术、放化疗被广泛用于结直肠癌的治疗,然而治疗期间,肿瘤细胞对放化疗产生抵抗耐受,残癌细胞无疑成为治疗的重大阻碍。因此,探究潜在耐放化疗的分子机制,开发靶向药物至关重要。微RNAs（microRNAs）是一种单链RNA分子,由约20个核苷酸组成,miRNA异常表达,可下游调控靶基因异常表达,促进CRC的癌变和进展。研究表明miR-212-5p在CRC组织以及细胞系内表达明显削弱,且细胞表型实验显示外源过表达miR-212-5p能抑制CRC细胞增殖、侵袭。CTEN/TNS4（COOH-termibus tensin-like molecule,CTEN）,前期研究显示其在体外以及体内均能促进肠癌的发生和发展,刺激上皮间质转化,促进迁移和侵袭。通过生物学软件（MIRDB）预测寻找到miR-212与CTEN存在结合位点,本研究探讨miR-212-5p是否可通过靶向CTEN基因调控结直肠癌化放疗敏感性机制研究。方法:收集20例结直肠癌患者的癌组织以及癌旁5cm处正常肠道粘膜组织标本,RT-PCR方法检测靶标miR-212-5p以及CTEN基因表达情况。选取HCT116、CCL244两种结直肠癌细胞系,构建HCT116、CCL244耐放化疗残癌细胞株,通过CCK8以及克隆形成实验评估细胞株耐化疗药物以及放疗抗性情况。用于后续实验开展。实验分组NCM460（正常肠上皮细胞株）、HCT116（结直肠癌细胞）、HCT116/CRR（耐放化疗残癌细胞）,CCL244（结直肠癌细胞）,CCL244/CRR（耐放化疗残癌细胞）,采用RT-PCR检测miR-212-5p以及CTEN基因表达的差异情况。接着外源过表达miR-212于两种CRR细胞株,相较miR-NC组别,RT-PCR验证miR-212过表达情况,并且检测CTEN基因表达水平变化,CCK8法检测细胞增殖活力,Transwell检测细胞迁移、侵袭能力,流式检测细胞凋亡能力,CCK8和克隆形成实验检测细胞耐化放疗能力。双荧光素酶报告基因检测miR-212和CTEN相互作用。采用miR-212以及CTEN 共转染于 HCT116/CRR、CCL244/CRR,通过 RT-PCR、Western-Blot 检测 CTEN基因表达情况,CCK8法检测细胞增殖活力,流式检测细胞凋亡能力,Transwell检测细胞迁移、侵袭能力,CCK8和克隆形成实验检测细胞耐化放疗能力。结果:（1）结直肠癌组织相较癌旁正常组织,其miR-212-5p表达明显削弱,而CTEN表达有所升高,两者呈现负相关,具有统计学意义（p＜0.5）（2）HCT116、HCT116/CRR、CCL244、CCL244/CRR 相较正常肠上皮细胞NCM460,miR-212-5p表达明显减弱,而CTEN表达升高,具有统计学意义。另外HCT116/CRR、CCL244/CRR两种细胞株分别相较野生型HCT116、CCL244细胞,miR-212-5p表达明显减弱,而CTEN表达升高,具有统计学意义（p＜0.5）。（3）过表达 miR-212-5p 于 HCT116/CRR、CCL244/CRR,miR-212-5p 表达明显升高,CTEN表达明显降低,细胞增殖、细胞迁移以及侵袭能力,凋亡能力增强,明显削弱放疗、化疗抵抗耐受。（4）双荧光素酶报告基因检测miR-212-5p与CTEN存在相互作用。（5）共转染 miR-212-5p 以及 CTEN 于 HCT116/CRR、CCL244/CRR,CTEN 表达有所回升,相较单独转染miR-212 mimics,细胞增殖、迁移、侵袭能力有所增强,凋亡能力减弱,放疗、化疗抵抗耐受能力增强。结论:miR-212-5P可通过靶向CTEN基因调控结直肠癌细胞放化疗敏感性机制应答。
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