目的外伤、感染、肿瘤等疾病导致的骨缺损在临床上发病率较高,有效的修复仍是整形外科目前的难题之一。目前可采用的方法包括传统的骨移植术、自体材料与人工材料相结合的组织工程技术、最初产生于牙周治疗的膜引导性组织再生技术、能够提高生长因子效率的基因工程技术等,临床上以骨移植术为主。与其他组织移植相似,临床上根据移植物的来源将骨移植主要分为自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植、人工骨移植以及组织工程骨移植。自体骨移植物是干细胞、成骨支架和生长因子的异质复合物,保持自体骨移植物的活性是维持其成骨潜能的关键。临床医生认为,缩短自体骨移植物在体外保存的时间至关重要。此外,由于松质骨中骨祖细胞含量丰富,因此与皮质骨相比具有更强的成骨能力。然而,影响自体骨移植物成骨能力的因素有很多,虽然国内外学者对其展开了大量的研究,但仍存在许多争议。获取骨移植物后,与干燥环境相比,将其保存在溶液中更能保持其活性,但不同溶液对骨移植物活性的影响尚不清楚。同时,保存移植物时的温度也存在争议。无论是哪种因素,维持自体骨移植物的活性是其成骨的关键。Wnt信号通路是经典的成骨相关信号通路,由内源性Wnt信号分子激活后可调控间充质干细胞的成骨分化。能够识别内源性Wnt信号分子的细胞称为Wnt应答细胞。Wnt蛋白是一种细胞外蛋白,具有多种生物学功能,参与体内多项生理功能的调控。它作为调节人骨量和骨折愈合的蛋白,其表达可以激活Wnt信号通路进而调控间充质干细胞的成骨分化,减少成骨细胞的凋亡与坏死,促进成骨细胞的增殖和迁移,提高自体骨移植物的活性。Wnt蛋白共有19种。现有的数据提示,Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7b、Wnt10b、Wnt16可以影响成骨细胞的活性。其中,Wnt3a分泌的速率最快,因此最容易制备和纯化。有研究指出,Wnt3a可以激活β-catenin,进而激活经典Wnt/β-catenin信号通路。但与以往认识相反的是,Wnt3a激活经典Wnt/β-catenin信号通路后,促进了间充质干细胞的增殖,抑制了其分化,从而保持了间充质干细胞的活性。因此,本研究拟使用Wnt3a蛋白激活自体骨移植物中Wnt信号通路。Wnt3a蛋白是一种脂质修饰后的蛋白,具有高度疏水性,因此转运时需要特定的介质。哺乳动物体内的Wnt蛋白通过脂质囊泡在细胞之间传递,保持了Wnt蛋白的活性。为了模拟这种转运模式,我们使用人Wnt3a蛋白的脂质体制剂（L-WNT3A）,以保持其在生理温度下的稳定性。本实验拟明确自体骨移植物成骨能力的来源以及自体骨移植物离体后保存的时间、温度以及溶液对其成骨能力的影响,进而探究通过调整自体骨移植术中各项影响因素、改善自体骨移植物成骨能力的可行性。本实验有助于开发一种临床治疗方法,改善患者的自体骨移植功效,加速骨修复。方法1.实验动物:Lewis大鼠购自Charles River并用于脊柱融合实验。所有其他实验使用小鼠。为了模拟自体骨移植,将同基因鼠用于骨移植。野生型、β-actin-GFP和Axin2LacZ/+小鼠来自Jackson Labs,Axin2CreERT2/+;R26Rm TmG/+小鼠由来自Jackson Labs的Axin2CreERT2/+和R26RmTm G/+小鼠产生。小鼠骨骼成熟为8-16周龄,老年小鼠为>12月龄。2.手术方法:SRC骨移植,胫骨单皮质缺损骨移植,颅顶骨移植,上颌无牙嵴缺损骨移植,OVX手术。3.检测方法:组织学:苯胺蓝,ALP、TRAP活性和五色染色法;免疫组织化学染色;细胞活性检测:TUNEL染色、台盼蓝染色、Caspase3活性;qRT-PCR;内吞作用测定;Wnt活性的测定。4.统计方法:结果表示为平均值±标准偏差。采用双尾学生t检验和单因素方差分析两种方法用于确定数据之间的显著差异。P值<0.05认为是差异显著,具有统计学意义。结果1.自体骨移植物移植后,存活的细胞富集在矿化基质周围。与骨髓细胞部分相比,骨移植物的矿化基质部分表现出明显的增殖能力和成骨活性。2.尽管在矿化基质部分和DBM中的骨碎片都是失活的,并且被密集的细胞群包围,但DBM中的Runx2阳性细胞很少,且ALP活性最低,与自体骨移植物相比,其成骨能力较差。3.Wnt应答细胞主要存在于骨移植物的矿化基质表面,为骨祖细胞。在修复时,这些细胞参与成骨分化的过程,直接促进骨再生,其数量受自体骨移植物的供体年龄影响。4.随着离体时间的增加,凋亡细胞的数量持续增加,细胞活力下降,而从相同动物获取的相同体积的骨移植物生成的新骨骨量也减少。随着离体时间的增加,Wnt应答细胞群逐渐凋亡。5.当骨移植物在4℃离体即刻时,细胞坏死处于最低水平。当骨移植物在37℃下离体1小时时,细胞坏死最多。尽管细胞坏死程度存在差异,但在37℃保存1小时的骨移植物产生的新骨量与在23℃保存的骨移植物相同。然而,如果将骨移植物保存在4℃,则比在23℃下保存的骨移植物形成的新骨的量增多。与保存在4℃下的骨移植物相比,保存在23℃和37℃下的骨移植物具有较少的Wnt应答细胞,骨移植物的成骨能力也降低。6.在4℃生理盐水中保存自体骨移植物可以保持细胞活力,相反,将自体骨移植物保存在37oC生理盐水中会降低细胞活力。无论保存温度如何,在含10%FBS的DMEM溶液中孵育的骨移植物的成骨能力均强于生理盐水中保存的骨移植物。7.L-WNT3A处理的自体骨移植物显示出更强的成骨能力和更高的成骨蛋白表达,同时可以恢复骨质疏松动物的成骨能力。结论1.自体骨移植物中附着于矿化基质的Wnt应答细胞为骨祖细胞,是自体骨移植物成骨能力的来源。2.在生理温度下,L-WNT3A可以极大程度地增强自体骨移植物的细胞活性、增殖能力和成骨潜能,提高自体骨移植物的成骨能力。