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肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展是一个与多种基因的异常改变相关的复杂过程,迄今具体的分子机制尚不完全清楚。人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(Human Abnormal Spindle-like Microcephaly-associated,ASPM),位于染色体1q31,全长62528bp,编码区长10434bp,由28个外显子构成。最初发现其在胚胎期神经形成中起关键作用,控制大脑的容量,其基因突变与神经发育缺陷性的常染色体隐性遗传小头畸形的主要原因发病相关。随着研究的深入,发现ASPM在增殖旺盛的组织及肿瘤组织中高表达。我们前期实验结果发现ASPM在肝癌组织中表达水平明显上调,由此,我们推测ASPM可能参与肝癌的发生、发展。经典的Wnt/β-catenin信号在大多数的肝癌中都异常活化,我们前期研究发现,ASPM在肝癌组织中的表达水平与β-catenin的表达水平显著相关。基于此,我们提出ASPM可能通过调控Wnt/β-catenin信号途径影响肝癌的发生发展。本课题主要从两个方面进行研究:(1)ASPM在肝癌组织与癌旁组织中的表达水平、临床病理学意义及其与Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子的关系;(2)ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制研究。方法1人肝组织中ASPM的表达水平及临床病理学意义研究1.1应用RT-qPCR法检测肝癌及癌旁组织中ASPM mRNA的表达水平,分析ASPM在肝癌及癌旁组织中的表达水平及与临床病理学意义;1.2应用Western Blotting及免疫组化方法检测肝癌及癌旁组织中ASPM蛋白的表达水平,分析ASPM蛋白在肝癌及癌旁组织的水平;1.3应用RT-qPCR法检测肝癌及癌旁组织中Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子mRNA的表达水平,分析ASPM与Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子mRNA表达水平的相关性。2 ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究2.1应用RT-qPCR方法检测肝癌细胞株中ASPM的表达水平,筛选出干扰效果最优shASPM序列,构建慢病毒介导的ASPM-shRNA肝癌细胞株;2.2用CCK-8、划痕修复、Transwell实验方法检测稳定沉默ASPM对肝癌细胞增殖能力、迁移能力以及侵袭能力的影响;2.3运用Western Blotting技术检测稳定沉默ASPM及对照组中Wnt/β-catenin信号通路中Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1的蛋白表达水平。结果1人肝组织中ASPM表达水平及临床病理学意义1.1人肝组织中ASPM mRNA的表达水平及临床病理学意义利用RT-qPCR的方法,对102例人肝标本ASPM mRNA进行定量,其中肝癌组织和非癌组织各96例,配对的癌与癌旁组织90例。结果显示肝癌组织中ASPM mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.00001)。90例配对的样本中,69例肝癌组织ASPM高表达,高表达率为76.7%。对102例肝癌组织及癌旁组织按照肿瘤大小、肝硬化程度、AFP表达水平分组分析ASPM mRNA表达差异,结果显示,各分组中癌组织均显著高于癌旁组织(P<0.05)。值得注意的是,患者AFP在正常范围(AFP≤20ng/mL),肝癌组织中ASPM mRNA表达水平依然显著高于癌旁组织(P=0.048)。根据有无癌栓、有无血管侵犯、肿瘤分化程度分析发现,发生癌栓、有血管侵犯、中分化及低分化组,肝癌组织中ASPM mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P≤0.01)。而高分化,无癌栓及无血管侵犯组肝癌组织ASPM mRNA表达水平与癌旁组织相比无统计学意义(P>0.05),这说明ASPM表达水平与有无癌栓、有无血管侵犯、肿瘤分化程度相关,提示ASPM表达上调与肝癌患者不良预后相关,有可能成为评估肝癌患者不良预后的新型分子标志物。对96例肝癌组织的分析发现:重度肝硬化组ASPM mRNA表达水平显著高于中度肝硬化组(P=0.011),低分化组ASPM mRNA表达水平显著高于高分化组(P=0.017)。这说明ASPM mRNA的表达水平与肿瘤的分化程度、肝硬化程度密切相关。1.2不同种类的肝癌患者组织ASPM mRNA的表达水平根据临床诊断把102例人肝标本分为5组:HBV相关原发性肝细胞癌(HBV-HCC,74例)、术后复发的HBV相关原发性肝细胞癌(HBV-RHCC,10例)、非HBV原发性肝细胞癌(HCC,4例)、原发性胆管细胞癌(ICC,7例)以及肝转移瘤(MCC,7例)。分析发现74例HBV-HCC肝癌组织中,ASPM mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.00001),71例配对的样本,52例肝癌组织高表达,高表达率为73.2%;HBV-RHCC肝癌组织ASPM mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P=0.003),9例配对样本肝癌组织全部高表达,表明ASPM mRNA表达水平与HBV-HCC术后复发密切相关;与癌旁组织相比,ICC癌组织中ASPM mRNA表达水平显著升高(P=0.02);HCC、MCC中癌旁组织与癌组织ASPM mRNA表达水平无统计学差异,但肝癌组织ASPM mRNA表达水平依然高于癌旁组织。ASPM在所检测的5中不同类型肝癌的癌组织中表达水平均高于癌旁组织,这提示我们ASPM有可能作为广谱抗肝癌药物的治疗靶点。1.3 HBV-HCC ASPM mRNA的表达水平及临床病理学意义对74例HBV-HCC肝癌组织及癌旁组织ASPM mRNA表达分析发现,肿瘤直径>5cm、发生癌栓、血管侵犯、AFP>20ng/mL、轻度及中度肝硬化、低分化及中分化组,癌组织ASPM mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P≤0.01)。对HBV-HCC肝癌组织中ASPM mRNA的表达水平分析显示:重度肝硬化组ASPM mRNA表达水平显著高于中度肝硬化组(P=0.041)。1.4肝癌组织中ASPM的蛋白表达水平显著高于癌旁组织免疫组化对32例配对肝癌及癌旁组织ASPM的蛋白水平定量,结果显示23例肝癌组织中ASPM表达水平高于癌旁组织,高表达率为71.9%。Western Blotting检测65例配对肝癌及癌旁组织ASPM的蛋白水平,结果显示48例肝癌组织ASPM表达水平高于癌旁组织,高表达率为73.8%。肝癌组织中ASPM蛋白水平的高表达率与mRNA水平基本一致。1.5 ASPM与Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1 mRNA表达水平具有相关性利用RT-qPCR的方法,对102例人肝标本Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1mRNA表达水平定量,数据均呈非正态分布,用Spearman相关分析分析显示,ASPM与Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1 mRNA表达水平均有显著相关性(P<0.001)。2 ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究2.1 SMMC-7721、HepG2慢病毒干扰ASPM细胞系的建立为进一步研究ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制,分别用肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721建立慢病毒干扰ASPM的肝癌细胞系,探索ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制。2.2 ASPM对肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响CCK-8检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721不同组别(Scrambled Control组、shASPM组)细胞增殖能力,结果显示,稳定干扰ASPM后,SMMC-7721及HepG2细胞增殖能力显著下降。划痕修复实验检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721不同组别(Scrambled Control组、shASPM组)细胞迁移能力,结果显示,稳定干扰ASPM后,SMMC-7721及HepG2细胞迁移能力显著下降。Transwell实验检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721不同组别(Scrambled Control组、shASPM组)细胞侵袭能力,结果显示,稳定干扰ASPM后,SMMC-7721及HepG2细胞侵袭能力显著下降。2.3慢病毒干扰ASPM后,Dvl-2、TCF4、LEF1表达变化Western Blotting检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721不同组别(Scrambled Control组、shASPM组)中Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1蛋白表达水平,结果显示,沉默ASPM后,Wnt/β-catenin信号通路下游重要开关分子Dvl-2、TCF4及LEF1的表达水平明显下调,β-catenin无明显变化。结论1与癌旁组织相比,ASPM在肝癌组织中高表达。2 ASPM mRNA对于AFP水平正常的肝癌有判断预后的价值,与AFP联合会有更好的诊断互补性;ASPM表达水平与肝癌肿瘤的分化程度、肝硬化程度、HBV-HCC术后复发及不良预后密切相关;ASPM有可能作为广谱抗肝癌药物的治疗靶点。3 ASPM可通过促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭调控肝癌恶性生物学行为。4 ASPM可调控Wnt/β-catenin信号通路上的Dvl-2、TCF4、LEF1表达水平,可能通过Dvl-2调控TCF4、LEF1促进肝癌的发生发展。