论文部分内容阅读
目的:(1)通过lncRNA(Long non-coding RNA)芯片筛选出急性白血病(Acute leukemia,AL)患者和正常人中具有差异表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA),寻找能够指导AL患者预后的分子生物学标志物。(2)利用RT-qPCR(Real-time Quantitative PCR)方法在AL患者和正常人标本中验证芯片结果,同时对患者的预后进行分析,了解lncRNA ENST00000519507、lncRNA ENST00000488259、lncRNA ENST00000604266、lncRNA ENST00000511270、lncRNA ENST00000487332、lncRNA ENST00000547417、lncRNA ENSG00000228113、lncRNA ENST00000461818、lncRNA ENST00000545379、lncRNA ENST00000551855是否有望成为预测AL发生、发展及预后的一个分子标志。方法:(1)使用lncRNA芯片检测3例急性粒细胞白血病部分分化型-2a(Acute myelogenous with maturation 2a,AML-M2a)患者和3例正常人骨髓单个核细胞中具有差异表达的lncRNA,对原始数据标准化处理后进行GO、ECGG等生物信息学分析,寻找与之相关的转录因子、表达蛋白及信号通路,预测有望指导AL诊断、治疗及预后的5个高表达和5个低表达的lncRNA。(2)收集138例AL患者和120例正常人标本,利用qPCR方法检测lncRNA芯片筛选出异常表达的lncRNA表达水平,运用统计学原理及方法分析并验证基因芯片的检测准确度。(3)在110例可行临床预后分析的AL患者中,经ROC曲线分析人群验证中具有差异表达的lcnRNA的最佳截断值,将差异表达基因分为高表达组和低表达组,统计分析不同表达水平下AL患者的预后,寻找对AL患者预后具有指导意义的lncRNA。(4)在7例行异基因造血干细胞移植的患者中,分析差异lncRNA高低表达组患者的预后有无统计学意义。结果:(1)lncRNA基因芯片检测结果显示,AL患者与正常人中存在大量异常表达的lncRNA。按照Fold change≥2.0且P≤0.05的筛选标准,共筛选出9199个异常表达的lncRNA,其中5969个高表达的lncRNA,3230个低表达的lncRNA。(2)原始数据标准化处理后,行lncRNA功能分析。功能分析(molecular function)显示:高表达lncRNA分子功能主要富集在金属离子结合,多聚腺苷酸尾RNA结合,DNA结合。低表达lncRNA分子功能主要富集在受体结合,糖结合,跨膜信号传导受体活性。生物过程(biological process)分析显示:高表达lncRNA生物过主要富集在基因转录、翻译及其调节。低表达lncRNA生物过主要富集在免疫反应,炎症反应,细胞表面受体信号通路。细胞组分(cellular component)分析显示:高表达lnc RNA主要富集在细胞核,核仁,核糖体亚基。低表达lnc RNA主要富集在细胞质膜,细胞外泌体,溶酶体。Pathway分析显示:利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析,高表达lnc RNA代谢通路主要有核糖体代谢,RNA转运,核苷酸代谢。低表达lnc RNA代谢通路主要有破骨细胞分化,细胞因子与细胞因子受体相互作用,自然杀伤细胞介导的细胞毒性。(3)按差异表达显著性FC值排序,选取高低表达组差异显著的5个lnc RNA,最终筛选出lnc RNA ENST00000519507、lnc RNA ENST00000488259、lnc RNA ENST00000604266、lnc RNA ENST00000511270、lnc RNA ENST00000487332、lnc RNA ENST00000547417、lnc RNA ENSG00000228113、lnc RNA ENST00000461818、lnc RNA ENST00000545379、lnc RNA ENST00000551855作为后续人群验证及生存分析的基因。(4)q PCR法在138例AL和120例正常人中的检测结果显示:10个异常表达的lnc RNA中lnc RNA ENST00000545379、lnc RNAENST00000461818显示出高表达,lnc RNA ENST00000488259显示出低表达,本次芯片检测结果与人群验证结果的一致率在70%。(5)lnc RNA ENST00000519507在AL患者中表达水平比正常人外周血高(P<0.0167),且表达水平的高低在急性髓细胞白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)和急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)中无明显统计学差异。lnc RNA ENST00000488259在AL和正常人中表达水平不具有统计学差异,但正常人骨髓比外周表达水平升高,且有统计学意义(P<0.0167)。lnc RNA ENST00000604266在AL患者中表达水平比正常人骨髓和外周血均高(P<0.0167),且表达水平在AML和ALL白血病中无明显统计学差异。lnc RNA ENST00000487332在AML患者中表达水平比正常人外周血高(P<0.0083),且AML和ALL中表达水平存在明显统计学差异(P<0.0083)。lnc RNA ENST00000547417在AML患者中表达水平比正常人外周血降低(P<0.0083)。lnc RNA ENST00000545379正常人骨髓比外周表达水平升高,且有统计学意义(P<0.0167)。lnc RNA ENST00000551855在AL患者中表达水平比正常人外周血低(P<0.0167),且正常人中骨髓表达水平比外周血低(P<0.0167)。(6)生存分析结果显示:年龄、白细胞数、lnc RNA ENST00000519507、lnc RNA ENST00000545379是患者总生存(OS)的影响因素。年龄、白细胞数、lnc RNA ENST00000519507、lnc RNA ENST00000547417、lnc RNA ENST00000545379是患者无进展生存(EFS)的影响因素(p<0.05)。lnc RNA ENST00000547417、lnc RNAENST00000551855是影响造血干细胞移植患者总生存(OS)及无事件生存(EFS)的影响因素。其中白细胞、lnc RNA ENST00000547417、lnc RNA ENST00000519507、lnc RNA ENST00000545379是患者EFS的独立影响因素。结论:(1)lncRNA芯片检测结果显示,AL患者与正常人中存在着大量异常表达的lnc RNA,且不同的lnc RNA可与多种蛋白、转录因子、通路相关联。(2)lnc RNA芯片检测与q PCR验证结果一致率在70%。lnc RNA在AML、ALL、正常人骨髓、正常人外周血表达水平存在显著差异,表明其可能通过不同作用机制参与白血病的发生发展。(3)lnc RNA ENST00000519507、lnc RNA ENST00000547417、lnc RNA ENST00000545379、lnc RNA ENST00000551855与AL患者及造血干细胞移植后患者预后相关,有望成为判断AL及造血干细胞移植后患者预后侧分子生物学标志物,但其具体作用机制还有待进一步研究。