【摘 要】
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嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T）细胞制剂是一种新型治疗用生物制品,尚未见相关的含量检测方法学研究的报道,且常用的检测试剂在特异性和灵敏度方面不尽如人意。为了获得稳定、准确的数据,本研究基于流式细胞检测技术,利用一种全新的兔源抗FMC63多克隆抗体,建立了一种用于定量Anti-CD19-CART（FMC63 Scfv）细胞百分含量以及
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嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T）细胞制剂是一种新型治疗用生物制品,尚未见相关的含量检测方法学研究的报道,且常用的检测试剂在特异性和灵敏度方面不尽如人意。为了获得稳定、准确的数据,本研究基于流式细胞检测技术,利用一种全新的兔源抗FMC63多克隆抗体,建立了一种用于定量Anti-CD19-CART（FMC63 Scfv）细胞百分含量以及不同亚型CAR-T细胞含量的检测方法。本研究不仅全面考察了流式细胞术检测Anti-CD19-CART细胞制剂中CD3+CAR+/CD4+CAR+/CD8+CAR+细胞含量检测方法的专属性、线性、准确度、精密度等,而且利用实验设计（Design of experiments,DOE）以及统计学的方法对检测方法的影响因素进行系统性分析。兔源抗FMC63的多克隆抗体（R19多抗）是一种新型的Anti-CD19-CART（FMC63 Scfv）细胞检测试剂。本研究首先利用流式细胞检测技术,将R19与传统检测试剂进行了比对,并对R19多抗检测Anti-CD19-CART（FMC63 Scfv）细胞的特异性和灵敏度进行了初步评估。根据CAR-T细胞制剂的质控需求,我们设计了四色三参数的流式检测方法用于Anti-CD19-CART细胞制剂的含量检测,并对方法进行了全面的验证,包括以下内容:（1）专属性:我们研究了在流式检测中R19对于FMC-63-CART细胞的结合特异性;此外,利用强制降解方案来评估死亡细胞和细胞碎片对于R19检测特异性的影响。（2）线性范围:在产品的实际检测CAR-T细胞制剂含量范围内,利用标准品FMC63-CART细胞考察本检测方法的三个检测指标的线性响应。（3）准确度:在高、中、低三个不同标准品CAR-T细胞含量条件下,通过计算加标供试品的加标回收率评估本方法的准确度。（4）精密度:分别在不同时间段、不同仪器和不同检测人员的条件下,重复多次检测相同供试品,通过计算RSD值评估本方法的精密度。（5）耐用性:设计正交实验方案对检测操作中可能的变动因素进行分析,通过正交试验数据建立数学模型确定主要影响因素。最后设计单因素变动试验对主要影响因素进行验证。主要研究结果如下:（1）流式检测结果的分离度结果显示R19对于冻存的Anti-CD19-CART细胞检测效能优于常用的检测试剂。（2）在流式检测过程中,R19多抗能够特异性地与Anti-CD19-CART细胞结合,与其他scfv-CAR-T细胞无显著的交叉结合。强降实验数据表明Anti-CD19-CART细胞产品中的少量（<20%）死亡细胞或碎片对检测数据有显著性影响,这种差异主要是因为死亡细胞造成,但成品检测细胞活率均在90%以上,不存在此种问题。故专属性实验结果提示本方法对正常的Anti-CD19-CART细胞产品检测专属性良好。（3）本研究分析了三个检测指标在不同检测条件下的线性响应,通过40条标准曲线的结果分析,在常见的工艺范围之内（CD3+CAR+细胞含量约为10%-90%;CD4+CAR+细胞含量约为10-90%;CD8+CAR+细胞含量约为5%-90%）,R~2均大于0.99,所有检测指标线性良好。（4）本研究的数据显示各浓度条件下加标回收率均在80%-110%之间;各种实验条件下（日内,仪器间,人间,日间-稳定性样品）,RSD小于17%;上述准确度以及精密度结果均符合FDA对生物制品检测方法的技术要求。（5）利用正交试验数据建立的响应模型显示,细胞采样量对检测指标造成了最为显著的影响,应在检测中对细胞采样量进行精确的控制。综上所述,本研究建立了Anti-CD19-CART细胞制剂的含量检测方法,该方法具有良好的专属性、准确度、精密度、线性。通过耐用性研究,我们对本检测方法的可变因素进行了全面分析,确定了本检测方法的最显著的影响因素。
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