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肌内脂肪沉积的调控对提高动物生产效率具有重要的意义。肌内脂肪的沉积影响着肉质品质,了解脂肪在肌内脂肪与皮下脂肪差异沉积的机制,通过提高肌内脂肪沉积的同时,不影响甚至减少皮下脂肪沉积,对于提高猪肉品质,降低经济浪费至关重要。核受体辅激活蛋白3(Nuclear receptor coactivator 3,NCOA3)是固醇类辅激活蛋白家族的一员,有实验证明,NCOA3通过与C/EBPδ和C/EBPα相互作用调控PPARγ2转录活性,在脂肪分化和代谢中发挥重要作用。为了研究皮下与肌内脂肪组织的差异沉积机制,我们通过生物信息学分析,了解NCOA3的蛋白结构,通过构建启动子缺失报告载体,分析NCOA3的启动子活性。同时比较皮下脂肪组织与肌内脂肪组织中NCOA3的表达水平,并从甲基化表观调控水平上寻找NCOA3在两种组织中的表达差异机制,为特异性调控肌内脂肪的沉积提供理论依据。结果如下:1猪NCOA3基因的生物信息学分析NCOA3基因mRNA含有4173bp的开放阅读框,编码1390个氨基酸,蛋白分子量为151.2kDa。不存在信号肽和跨膜结构,具有极强的亲水性及复杂的螺旋结构,但稳定性不好,这可能与其结构、功能的复杂性有关。通过比较人、鼠以及猪的NCOA3氨基酸序列,发现三者具有极高的相似性(88.16%),因此可以基于NCOA3在人与鼠上的研究推测其对猪中脂肪分化的影响。2猪NCOA3基因5’侧翼序列缺失报告载体的构建与启动子活性分析构建了猪的六个双荧光素酶报告基因表达载体,瞬时转染到PK15细胞和猪的肝细胞中检测荧光活性。结果表明,猪NCOA3基因的核心启动子位于上游-150～-3bp之间,通过预测发现猪的NCOA3基因启动子区只存在一个CpG岛,且位于上游-930～-699bp。对其启动子区进行转录因子预测,发现在CpG岛内含有SP1、c-Jun、CREBP1、CEBPδ等转录因子结合位点,其中SP1为甲基化敏感位点。推测CpG岛可能影响NCOA3的启动子活性。3猪NCOA3基因CpG岛甲基化水平与其表达水平利用实时定量PCR(RT-qPCR)比较皮下脂肪与肌内脂肪组织中NCOA3 mRNA的表达水平,发现NCOA43基因在肌内脂肪组织中的表达量显著低于其在皮下脂肪组织的表达,两者差异极显著(P<0.01)。同时采用亚硫酸盐测序(BSP)方法检测NCOA3基因CpG岛的甲基化水平,发现该CpG岛总体甲基化水平在皮下与肌内脂肪组织中分别为83.5%和90%,但是差异不显著(P=0.11)。对CpG岛进行单位点分析,结果表明-904位点甲基化程度在皮下与肌内脂肪组织间差异显著(P<0.05),其中皮下脂肪的甲基化比例为20%,肌内脂肪甲基化比例为55%。为检测甲基化是否影响NCOA3基因的启动子活性,我们对NCOA3启动子进行体外甲基化处理,发现甲基化转移酶处理后启动子活性显著下降(P<0.05)。同时转录因子预测发现-904位点附近(-903～-894bp)有一C/EBPδ结合位点,我们将该转录因子结合位点进行突变,瞬时转染测定荧光发现,突变后启动子活性极显著下降(P<0.05)。由此推测,启动子甲基化水平能够影响NCOA3表达活性,-904位点组织间的甲基化水平差异可能影响C/EBPδ与NCO43启动子区域的结合从而导致其在皮下和肌内脂肪组织的差异表达。