背景:血管钙化是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）最常见的病理改变之一,与慢性肾脏病患者出现心血管事件的可能性和严重程度紧密相关。慢性肾脏病患者钙磷代谢紊乱伴随尿毒症毒素明显增加,进而诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）向成骨表型转化,被认为是慢性肾脏病患者动脉钙化的主要调节机制,可通过炎症反应、氧化应激等生物学途径实现。最近研究发现,骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）及其衍生的外泌体在的疾病治疗方向取得了许多进展,尤其是对于心血管疾病。BMSCs是一种最早从骨髓分离得到的非造血干细胞,被认为是骨髓基质的前体细胞。BMSCs在标准培养条件下是贴壁生长,具有分化成为成软骨细胞、脂肪细胞及成骨细胞的潜能。在过去十年中已成为治疗多种疾病的有希望的治疗工具,来自BMSCs的条件培养基是众所周知的自体细胞因子的丰富来源,并且在目前的临床医学中普遍用于组织再生,可改善心肌梗死后的心脏功能,增加ALP活性和特异性成骨标志物如RUNX2、Msx2。外泌体是一种绝大部分细胞都可以分泌产生的具有脂质双层膜结构的微小膜泡,其直径约为40～150 nm。它的形成首先由细胞膜内陷形成内涵体,再由内涵体膜再次内陷并包裹胞内的各种信号分子,如:蛋白质、脂质、DNA和各种RNA（mRNA、miRNA、lncRNA）形成多泡体,由多泡体与细胞膜结合以胞吐的方式释放的膜状结构就为外泌体。外泌体产生后可以停留在产生外泌体细胞的附近,也可以将其包裹的信号分子释放到远处的受体细胞,即通过自分泌、旁分泌以及（或）激素样分泌的方式调节受体细胞功能。早期外泌体被认为它只是一种细胞的废弃物,而现在外泌体在癌症、免疫等多种疾病的预防、诊断与治疗中广泛研究。BMSCs产生的外泌体数量高于其他细胞类型,如成肌细胞,急性单核细胞白血病细胞或胚胎肾细胞。BMSCs在不同生长时期、不同的诱导条件下产生的外泌体携带的分子有所差异,在调节VSMCs成骨分化中起着关键性作用。外泌体通过与受体细胞膜融合,将信号分子传递入受体细胞,是细胞间通讯的重要载体。细胞在不同因素刺激下,衍生出外泌体的内容物也会出现一定的变化,具有作为可调控的药物载体的潜能。相比于年轻大鼠,老年大鼠的BMSCs衍生的外泌体可以诱导正常大鼠产生胰岛素抵抗,因此我们推测不同年龄的BMSCs衍生的外泌体对VSMCs也可能产生不同的作用。综合以上研究背景,本课题将探讨不同年龄大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体（BMSCs-Exos）对VSMCs钙化的影响及机制。目的:探讨不同年龄大鼠BMSCs来源的外泌体通过影响Sp1的表达,参与调节血管平滑肌细胞钙化。方法:1.使用差速贴壁法分离培养原代SD大鼠BMSCs,超速离心法收集BMSCs来源外泌体。并通过透射电镜观察外泌体形态学特点,Western blotting法检测外泌体富集的标记蛋白CD9和Tsg101表达,以及通过纳米颗粒跟踪分析仪（Nano-particletracking Analysis,NTA）检测颗粒直径分布及对应数量。2.通过使用含和不含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠（β-GP）的完全培养基诱导VSMCs钙化,将实验细胞分为β-GP组和空白对照组,分别培养6天,9天,14天。茜素红S染色观察钙结节形成以判断体外血管平滑肌细胞钙化模型是否成功建立,RT-qPCR法和Western Blot检测Sp1、RUNX2和αSMA mRNA表达;Western blotting检测Sp1、RUNX2和αSMA蛋白表达水平。3.将BMSCs在无血清培养基中培养72小时,分别收集年轻大鼠（3月龄）组和老年大鼠（18月龄）的BMSCs条件培养基（condition medium,CM）,记为:Young-BMSCs-CM和Aged-BMSCs-CM;通过超高速离心机离心收集两组BMSCs-CM中的外泌体（exosomes,Exos）,记为:Young-Exos,Aged-Exos。将VSMCs分为空白对照组、β-甘油磷酸钠（β-GP）组、β-GP+年轻大鼠BMSCs-Exos（Young-Exos）组和β-GP+老年大鼠BMSCs-Exos（Aged-Exos）组。除空白对照组外,其他3组用含10 mmol/Lβ-GP的完全培养基培养14天,诱导VSMCs钙化。使用茜素红S染色法检测不同组别细胞的成骨分化情况。RT-qPCR法检测Sp1、RUNX2和αSMA mRNA;Western blotting法检测Sp1、RUNX2和αSMA的蛋白表达。4.体内实验使用3月龄的雄性SD大鼠,随机分为钙化组和对照组,每组各10只。钙化组通过背部皮下注射维生素D3（60万U/kg/天,连续6天）来诱导大鼠胸腹主动脉产生钙化,建立大鼠胸腹主动脉钙化的体内模型,对照组与相同部位注射等量的生理盐水。大鼠皮下注射诱导钙化期间正常饲养,自由饮食,直至干预结束3天后处死。分离大鼠胸主动脉,统一选取近心段保存于RNA保护液中后置于液氮中保存,用于核酸及蛋白检测,远心段使用4%多聚甲醛固定,用于制作病理切片。通过石蜡包埋后切片,使用钙盐硝酸银染色法（Von Kossa染色）和苏木精-伊红染色法（HE染色）观察大鼠胸主组织病理结构变化和钙盐沉积情况,以验证大鼠体内胸主动脉钙化模型的建立。使用免疫组织化学法和RT-qPCR检测Sp1、RUNX2和αSMA基因在钙化胸主动脉的表达情况,以探究体内和体外血管钙化的机制。结果:1.原代雄性SD大鼠BMSCs呈现贴壁生长,体积较大,为多角形,多数细胞有较长的突起,且互相连接。BMSCs阴性标志蛋白CD34和CD45表达阳性率均＜5%,标志蛋白CD44和CD90表达阳性率均＞95%。电镜观察BMSCs外泌体呈典型茶托型特征,Western blotting检测显示提取的外泌体标记蛋白CD9和Tsg101表达阳性,Zeta View颗粒浓度和直径分析显示待测颗粒悬液原始浓度为5.2×10~8 Particles/mL,粒径位于30～200nm之间。2.通过切片染色观察,与对照组大鼠主动脉切片相比,钙化组大鼠动脉结构紊乱,大量胶原纤维和弹性纤维遭到破坏,甚至出现明显的断裂和降解,中膜间可见大量黑色钙盐沉积,可得知大鼠体内动脉钙化模型建立成功;RT-qPCR检测Sp1、RUNX2表达在钙化组中明显增高,而αSMA基因在钙化组中明显下降,差异有统计学意义。免疫组织化学染色可见,相比于对照组,钙化组中Sp1、RUNX2的染色明显更深,表达量较高,αSMA颜色较浅,表达量较低。通过调整背景后计算单位面积密度分析,表达量差异均具有统计学意义。3.VSMCsβ-GP组相比于空白对照组染色可见更多红色或橘红色钙盐沉积结节,证明β-GP组诱导VSMCs钙化形成,并且当β-GP作用于VSMCs时间的延长至第6天、9天、14天时,钙盐结节明显增多,红色或橘红色钙盐结节数量变多,颜色更加明显。通过体外实验检测可知,当大鼠VSMCs出现成骨表型转化时,RUNX2基因在mRNA水平和蛋白水平均表达增高,差异有统计学意义,Sp1的基因水平和蛋白表达量也明显升高,差异有统计学意义。4.使用BMSCs-Exos干预后,β-GP+Young-Exos组较β-GP组和β-GP+Aged-Exos组钙盐结节数量明显减少,且橘红色着色浅。与空白对照组比较,β-GP组Sp1和RUNX2蛋白表达量升高,αSMA基因在蛋白水平表达量降低,差异有统计学意义;与β-GP组比较,β-GP+Young-Exos组Sp1和RUNX2蛋白表达量降低,αSMA蛋白表达量升高,差异有统计学意义,而β-GP+Aged-Exos组与β-GP组比较无明显差异（P＞0.05）。结论:本研究结果提示,通过使用维生素D3及β-GP药物,大鼠体内和体外钙化模型分别建立成功,促进VSMCs成骨分化,Sp1在钙化的血管平滑肌细胞和组织中表达上调。不同年龄大鼠BMSCs-Exos对动脉钙化的影响不同,其中Young-Exos干预能减轻VSMCs钙化,其机制可能与下调Sp1和RUNX2表达、上调αSMA表达有关。