低共熔溶剂双水相体系用于生物大分子的分离分析研究

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由于合成简易、成本低廉,低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent,DES)在众多领域得到广泛应用,尤其是应用于双水相体系(Aqueous Biphasic Systems,ABSs)。双水相体系是由两种水相溶的物质在一定浓度下分层形成,能够提供相对温和的环境,是一种绿色可持续性和环境友好型体系。通过大量的研究发现,基于低共熔溶剂的双水相体系不仅萃取性能良好,而且能够保证分析物的完整性,使得分析物在萃取前后不会发生变性失活等现象。此外,该体系制备简单,易于大批量工业化生产。蛋白质和核酸是研究生命活动的重要物质,所以通过分离纯化制备其纯品显得至关重要。色素在纺织工业和食品工业等方面应用广泛,准确快速地检测违禁色素含量是保证食品安全的重要措施。本文成功合成各种新型低共熔溶剂,并结合新的成相盐构建一系列低共熔溶剂双水相体系,进一步探究了该体系萃取牛血清白蛋白、RNA和苋菜红的性能。主要研究内容如下:(1)基于二元和三元的低共熔溶剂双水相体系萃取分离蛋白质本研究对比了二元和三元低共熔溶剂应用于双水相体系萃取分离蛋白质的性能差异,以牛血清白蛋白(BSA)作为目标蛋白进行萃取机理的探究。选用四甲基氯化铵(TMAC)作为氢键受体合成了四种二元和四种三元低共熔溶剂。通过相图可以发现二元低共熔溶剂的成相能力强于三元低共熔溶剂。其次,对比两者萃取能力可以发现,三元低共熔溶剂的萃取能力更佳。然后,选取四甲基氯化铵-尿素和四甲基氯化铵-尿素-甘油进行单因素实验,包括DES的质量、盐浓度、牛血清白蛋白的质量、温度和pH。优化萃取条件后,二元和三元低共熔溶剂的最佳萃取效率高达99.31%和98.95%。但反萃取实验证明了三元低共熔溶剂具有更大的优势,反萃取效率为71.89%,而二元低共熔溶剂仅为21.02%。最后,运用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、圆二色谱(CD)、动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)进行了萃取机理的研究。所拟方法表明三元低共熔溶剂结合双水相体系萃取蛋白质具有一定的优势,为设计功能化低共熔溶剂提供了新思路。(2)基于聚乙二醇的低共熔溶剂双水相体系萃取分离RNA合成了16种基于聚乙二醇(PEG)和季铵盐的新型低共熔溶剂,结合双水相体系萃取分离RNA。全面评估了氢键供体的分子量和含量、氢键受体的碳链长度和阴离子种类、成相盐的种类对成相的影响。其次,通过萃取RNA可以发现,PEG含量和分子量越小、季铵盐碳链长度越长和成相盐的疏水性越强越有利于萃取。然后,选取基于四丁基溴化铵(TBAB)/聚乙二醇600(PEG 600)合成的低共熔溶剂[TBAB][PEG600]和Na2SO4的体系进行单因素实验,在最佳萃取条件下,RNA的萃取效率达到99.76%左右,且表明静电作用是萃取RNA的主要驱动力。因此,通过调节离子强度可以使得反萃取效率达到85.19%到90.78%。此外,选择性萃取实验证明了86.19%RNA集中分布在下相,72.02%色素(Trp)主要分布在上相。最后,利用动态光散射和透射电镜进一步考察了萃取RNA的机理。本实验提出了低共熔溶剂双水相体系绿色高效萃取RNA的方法。(3)基于聚丙二醇的低共熔溶剂双水相体系萃取分离苋菜红本实验运用聚丙二醇400(PPG 400)和四丁基溴化铵(TBAB)合成低共熔溶剂,选择不同种类的新型盐作为成相剂构建低共熔溶剂双水相体系,例如季铵盐、氨基酸和多元醇。通过相图可以发现,在所研究的成相盐中多元醇类的盐成相能力稍逊色于其他种类的盐。此外,盐的碳链长度越短,越有利于促进相分离。选取疏水性不同的三种色素作为分析物,探究疏水性对于低共熔溶剂/PPG 400和盐溶液构建的双水相体系萃取效果的影响,结果表明色素疏水性越强越有利其富集在低共熔溶剂相。另一方面,盐的成相能力下降,所有体系萃取能力也随之下降。据此,运用PPG 400和甜菜碱的双水相体系选择性萃取分离色素,可以发现93.00%苏丹红Ⅲ分布在上相,而80.00%左右的日落黄和苋菜红趋向于富集在下相。进一步选用DES/甜菜碱体系进行单因素实验和反萃取实验,优化萃取条件后有98.00%的苋菜红可以被萃取到上相,只有67.98%的苋菜红能被反萃取到下相。最后,运用动态光散射和透射电镜进行萃取机理的探究,结果表明疏水性是萃取色素的主要驱动力。本实验致力于开发新型成相盐,并设计了环境友好型萃取色素的方式,促进了双水相体系在检测食品色素方面的进一步发展。
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