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人参是中国传统的珍贵中药材,为五加科多年生草本植物。人参皂苷是人参根、茎、叶等部位的主要活性成分,具有重要的药用价值。近年来随着人参皂苷需求量的不断增加,其天然提取量不能满足社会需要,而随着合成生物学研究的不断深入,该技术为人参皂苷的生产开辟了一条新途径。人参皂苷Rh2是一种具有高生物活性的皂苷。研究表明皂苷Rh2由2,3-氧化角鲨烯衍生而来,2,3-氧化角鲨烯在达玛烯二醇合成酶的作用下生成达玛烯二醇,达玛烯二醇在原人参二醇合成酶催化下生成原人参二醇,原人参二醇在原人参二醇三羟基一葡萄糖基转移酶的催化作用下生成原人参二醇型人参单体皂苷Rh2。本研究的主要目的为应用合成生物学方法,在人参体外构建一株酿酒酵母工程菌,利用酿酒酵母中本身存在着达玛烯二醇前体物质(2,3-氧化角鲨烯)的特性以及3种外源关键酶基因的共表达最终合成天然产物人参皂苷Rh2。本研究通过PCR方法扩增了人参发根中的原人参二醇合成酶基因(D12H)和原人参二醇三羟基一葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-3OH-1),将两基因依次与表达载体p ESC-URA连接,构建了酿酒酵母表达载体p ESC-D12H-UGT。该重组载体与含有达玛烯二醇合成酶基因(DS)的表达载体p AUR123-DS共同转化酿酒酵母YPH501,最终构建了酿酒酵母工程菌YPDDG。工程菌诱导表达后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)定性检测基因的表达,结果表明达玛烯二醇合成酶、原人参二醇合成酶和原人参二醇三羟基一葡萄糖基转移酶在YPDDG中均有表达。通过高效液相色谱法(HPLC)检测到目标产物人参皂苷Rh2,本研究的主要内容及结果如下:(1)实验室培养21d的人参发根中提取人参总RNA,通过反转录合成人参c DNA。运用Primer 5.0,参照Genebank中已登录的相近物种序列以及引入特定酶切位点的需求对D12H和UGT-D-3OH-1基因设计了特异性引物,以c DNA为模版,成功克隆出了D12H和UGT-D-3OH-1基因。(2)将人参皂苷Rh2生物合成途径的相关基因D12H和UGT-D-3OH-1分别与克隆载体p MD18-T连接,将所构建的重组载体分别命名为p T-D12H和p T-UGT,通过特定限制酶酶切和测序对重组载体进行了验证。(3)限制酶Bam H I和Kpn I分别酶切克隆载体p T-D12H和p ESC-URA,使用T4DNA连接酶成功将D12H基因与表达载体p ESC-URA连接,命名为p ESC-D12H。相同方法构建了表达载体p ESC-D12H-UGT。将重组载体p ESC-D12H-UGT和p AUR123-DS分别转染化酿酒酵母并通过不同筛选培养基筛选,PCR检测结果表明酿酒酵母工程菌YPDDG成功构建。(4)利用SDS-PAGE蛋白电泳定性检测酵母工程菌YPDDG中3种目的蛋白酶的表达,结果表明DS、D12H和UGT-D-3OH-1基因均于酿酒酵母宿主菌中表达。(5)通过高效液相色谱法(HPLC)检测酵母工程菌提取物中目标产物人参皂苷Rh2的合成,结果为3.74×10-2mg/L,表明本研究在人参体外成功构建了可合成人参皂苷Rh2的工程菌株。(6)从培养温度、p H、振荡转速以及装样量四个方面对重组酵母工程菌YPDDG的生长条件进行了优化,确定了适合YPDDG生长的条件:培养温度30℃、p H为7.5、振荡转速220rpm、装样量为80m L。在此培养条件下,YPDDG代谢产物中人参皂苷Rh2的含量为4.13×10-2mg/L。