苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对猪蛔虫作用效果的研究

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猪蛔虫是广泛分布于世界各地的大型寄生线虫,繁殖力强,对养猪业危害极大;猪蛔虫也感染人并引起人的疾病,世界卫生组织及一部分国家已将猪蛔虫病纳入人类公共卫生范畴。目前治疗猪蛔虫病的药物较多,如苯咪唑类药物、阿维菌素、噻嘧啶等,虽然其药物作用较好,但其毒副作用大、易残留,对动物和人体有害,在动物生产实际中均属于限制使用的药物;目前尚未见到商用猪蛔虫疫苗。无毒无害无限制使用的抗猪蛔虫药物不仅是畜牧业生产的实际需要,也具有广阔的市场前景。 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴胞晶体是广泛使用的微生物杀虫剂,与化学农药相比较,由于其对脊椎动物无毒性而选择性地作用于害虫、对环境无污染且能通过转基因技术应用于农作物而持久地发挥植物保护作用,这些毒素已被应用于有机农业。近些年来的研究证实,其对动物寄生线虫也有强效作用。寻找对猪蛔虫敏感的Bt菌株并将其应用于动物临床实践是本研究的目的。有关Bt对猪蛔虫的作用,国内外尚未见报道。 猪蛔虫卵在保湿防腐的条件下,28℃培养28d,发育成感染性虫卵。试验小鼠和猪在感染前后饲喂不加任何驱虫药物的饲料。每只小鼠一次经口感染约4,000个虫卵;每头猪(40kg)经口感染6×105个虫卵。试验猪被成功地复制出了猪蛔虫病,表现出了猪蛔虫病的临床症状;60d后对猪粪便进行检查,每克粪便中虫卵数高达7,100个,成功地复制出来猪蛔虫病理模型。该试验成功地在体外分离到了猪蛔虫第二期幼虫、第三期幼虫和第四期幼虫,为以后的实验打下了良好的基础。 试验小鼠在感染后第6d迫杀取肺脏,收集第四期幼虫(L4),用DMEM培养基配制成悬浮液,并定量至200~250条L4/ml。 将Bt 007、017、021、027、032、037、H14和HD1等八个菌株进行培养,提取伴胞晶体,碱溶提取蛋白质,测定晶体蛋白含量。分别将以土蛋白溶液以等体积的倍比稀释浓度加入到含有L4的微量培养孔中,设置对照和重复,观察其对猪蛔虫L4的作用效果。结果发现,作用时间直接影响L4的死亡率,培养24h无L4死亡,除H14和HD1外,60h时所有实验组的L4全部死亡,72h后对照组的L4全部死亡。对照组死亡率在48h前均为0.017菌株对L4在作用24h、36h和48h时的半数致死量(LDS。)分别为1 .23559/L,0.82209/L和0.64889/L.该菌株对L4毒力最强,H14和HD一1对L4几乎没有毒杀作用。 根据以上结果,选择017菌株大量培养,提取伴胞晶体蛋白,测定蛋白含量;将晶体蛋白冷冻干燥,定量制成肠溶胶囊;肠溶胶囊经口给猪投服,每日侧定每克猪粪便中的猪蛔虫卵数,计算百分率(以给药前粪便中的虫卵数为100%计),制作曲线并进行统计分析,研究其对活猪体内姻虫的作用效果。本实验虽没有将猪蛔虫完全驱除,但具有较好的驱虫效果。苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对猪蛔虫的作用十分明显。每克粪便中猪蛔虫卵数从试验前的100%下降至30.88%。实验的第4d、sd、7d,每克粪便中的虫卵数与试验前差异显著(P<0.05):第2d、3d、6d作用效果也很明显(0 .05<P<0.1)。在实验的第3d,部分猪粪便中出现了蛔虫。实验中,Bt驱虫作用呈缓慢的阶梯式进行,试验第Zd、第3d的效果相当,第4d、sd、6d间效果变化不明显,第7d每克粪便中的虫卵数进一步下降。 对猪仆、ALB、ALT、AST、A工P、CK一NAC、CR、CHOL、LDH一L、Glu、U比a等十一项临床生物化学指标研究显示,该伴胞晶体蛋白肠溶胶囊对猪血液生化指标的改变不显著(P>0.05),未见有任何临床症状,怀孕母猪没有出现流产征兆,后期跟踪无不良反应,说明其对猪的心功能、肌肉、肝脏、肾脏、消化吸收、代谢及繁殖等没有显著影响,没有诱发肿瘤的预兆。结果证明,伴胞晶体蛋白肠溶胶囊对猪无急性毒副作用。 根据对L4的毒力检侧结果,我们还进行了苏云金芽胞杆菌017菌株伴胞晶体蛋白对猪姻虫卵的体外毒杀试验,结果显示,017菌株对猪蛔虫卵孵化期间的各阶段没有明显的作用。 所有结果证明,苏云金芽胞杆菌017菌株是猪蛔虫的敏感高效菌株。017菌株对猪蛔虫的第四期幼虫和成虫均有较好的毒杀作用,但对猪姻虫卵无效。将苏云金芽胞杆菌017菌株的伴胞晶体蛋白制成肠溶胶囊,给猪口服,对猪体内猪蛔虫成虫也具有较好的抑制或杀灭作用,而且对猪无毒副作用,因而具有广泛地应用于牲猪生产的兽医临床实际的前景。 关键词:苏云金芽胞杆菌,伴胞晶体蛋白,肠溶胶囊,猪蛔虫,第四期幼虫,成虫,毒杀作用
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