光倒刺鲃饥饿应激的转录组分析及其生长相关基因的克隆

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光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),鲃亚科(Barbinae),倒刺鲃属(Spinibarbus),是一种广泛分布于分布于中国华南地区的淡水鱼类。光倒刺鲃肉质鲜美,具有一定的药用价值,适应环境能力强,食性多样等优点,深受水产养殖业和消费群体的欢迎。但是由于光倒刺鲃的生长缓慢限制了其推广。因此,本研究试图在投喂策略,生长相关基因克隆与研究,与生长相关的SNP位点的开发来改善光倒刺鲃的生长速率。本研究的主要结果如下:1.光倒刺鲃饥饿7天后,体重呈现略微降低的态势(1.14±0.07 g),显著低于对照组光倒刺鲃的体重(1.62±0.11 g),而再投喂7天后,光倒刺鲃的体重(1.50±0.1 g)仍然低于对照组(1.96±0.17 g),而再投喂33天后,饥饿再投喂组的体重(4.19±0.26 g)与对照组(4.28±0.30 g)没有显著差异。对肌肉组织的观察发现,当光倒刺鲃遭受饥饿时,肌肉细胞的横截面的大小会显著低于对照组,而再投喂33天后,光倒刺鲃实验组的肌肉细胞的横截面的长短径与对照组没有显著的差异。另外还对三个组的光倒刺鲃进行了转录组测序,结果显示:共有4499个基因出现了差异表达,饥饿时,上调的基因多与蛋白质的代谢,脂肪酸的转运与代谢,糖类的代谢密切相关。而下调的基因多与细胞的分裂与增殖,DNA的复制,细胞构架和功能的维持以及免疫等方面相关。另外,我们还发现了一部分在再投喂后相对于对照组过量表达的基因,这一部分基因可能与光倒刺鲃的补偿生长相关。2.对脑的差异表达基因研究发现,光倒刺鲃在遭受饥饿时,会尽可能的降低非生存相关基因的表达以保存能量。本实验对对照组,7天饥饿组和7天饥饿7天再投喂组的光倒刺鲃的脑进行了转录组分析。结果显示:共计936个差异表达基因被发现。根据Hcluster聚类分析,这些差异表达基因大部分可以分为四个分支,第一个分支主要表现为基因在饥饿组显著上调而饥饿再投喂组与对照组并没有显著差异,这些基因主要包括与能量代谢相关的基因;第二个分支表现为基因在正常投喂组和饥饿组的表达无明显差异,而这两个组与再投喂组有着显著的差异,这一部分基因包含较多的热激蛋白家族基因。第三个分支表现为基因在饥饿组的表达量显著低于对照组,而再投喂组与饥饿组的表达量相当,这部分基因主要包括细胞周期,类固醇的生物合成,DNA的复制通路等相关基因。第四个分支表现为基因在饥饿组和饥饿再投喂组的表达量显著低于对照组的表达量。最后我们使用Q-RTPCR的方法对转录组的数据进行了验证,结果与转录组数据相仿。脑作为机体的最高级别的神经中枢,当鱼类应对饥饿时,其调控作用是不可或缺的,作为神经中枢,脑在调度能量,调节机体的代谢平衡时都会起着重要作用。研究光倒刺鲃受到饥饿胁迫时脑的转录本的变化,有助于理解光倒刺鲃应激饥饿的方式,以及补偿生长效应机制。3.黑色素皮质素受体-4(MC4R)基因是黑色素皮质素家族的成员,其主要影响个体的发育,生长,代谢和食欲。在这项研究中,我们克隆了MC4R基因。MC4R基因全长3068 bp,编码区全长978 bp,共编码了326个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明,MC4R m RNA在各种组织中普遍表达,其中脑和性腺中表达丰度最高。我们还对生长性状极端组的脑中MC4R的表达量进行了研究,结果显示,光倒刺鲃低体重组的MC4R基因表达水平显着高于高体重组的表达量。另外我们还筛选到了6个SNP位点,其中四个在启动子中(-698A>G,-679C>T,-326C>T和-202A>G),两个在外显子(36A>G和234C>T)。其中三个SNPs,-698 A>G,-679 C>T和234C>T,与生长性状显著相关,-698 A>G和-679 C>T完全连锁。其他三个SNPs与生长性状没有显著的关联。本实验在MC4R基因中筛选的与生长相关的SNP可以作为分子标记用于光倒刺鲃的分子辅助育种当中。4.肌肉生长抑制素(MSTN)是鱼类骨骼肌发育和生长的负调节因子。在本研究中,我们对光倒刺鲃的MSTN基因进行了克隆和分析。光倒刺鲃的MSTN由三个外显子和两个内含子组成,开放阅读框含有1128个核苷酸,共编码375个氨基酸。光倒刺鲃的MSTN氨基酸序列与鸟类,哺乳动物和其他硬骨鱼类的MSTN有着66.6~98.4%的同源性。光倒刺鲃MSTN广泛地存在于各种组织中,在脑中表达量最高,在肌肉中次之。另外我们还研究了光倒刺鲃MSTN与生长性状的关联度,结果发现,在骨骼肌中,高体重组的光倒刺鲃拥有着较低的MSTN表达量,在脑中我们没有发现MSTN的表达量与光倒刺鲃的生长显著相关。另外,我们在MSTN中检测并验证5个SNPs,包括外显子2中的一个SNP位点(1196T>A)和内含子2中的4个SNP位点(1428C>G,1430T>G,1483A>G和1562A>C)。其中4个SNPs,1196T>A,1428C>G,1430T>G和1483A>G,与生长性状显着相关。在MSTN中鉴定的SNP位点可以用于后续光倒刺鲃的分子辅助育种实验。
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