论文部分内容阅读
淀粉酶产色链霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes 1628)可合成核苷类抗生素-丰加霉素(Toyocamycin,TM),丰加霉素对于多种植物病原真菌具有良好的抑制活性。课题组前期通过核糖体工程技术获得能够高低产丰加霉素的利福平抗性突变株1628-T15和1628-T62,为了从全局角度了解影响丰加霉素合成的关键节点,本文以原始菌株1628,突变株1628-T15和1628-T62三组微生物为研究对象,采用比较蛋白组学为技术手段,分析三组微生物的整体蛋白表达水平和显著差异蛋白,着重对其中三个调控蛋白与合成次级代谢产物的相关性进行初步研究。本文主要研究内容如下。首先,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术,对三组菌株1628-T15(H)、1628-T62(L)和1628(N)的显著差异蛋白进行分析,结果表明:三组微生物的总体蛋白表达水平相当,且下调蛋白数远超过上调蛋白数,表明丰加霉素产量的提高并非由于菌株蛋白合成水平引起,可能是由于多个竞争代谢途径的弱化所致。对多个显著差异表达蛋白进行归类分析,为考察丰加霉素合成的相关调控机制,筛选其中显著差异的三个转录调控蛋白X0P338(GntR)、X0MUI0(Crp)、A0A0C2B1U9(IclR)作为本文的研究对象扩增获得基因片段gntr(918 bp)、crp(1443 bp)、iclr(771 bp)。其次,扩增编码蛋白X0P338(GntR)的基因片段gntr,进行BLAST比对,其与多株链霉菌中FadR蛋白的氨基酸具有很高的同源性,证明该蛋白属于GntR转录调控家族的FadR亚族。将基因gntr在1628菌株中进行过表达构建重组菌1628-G,以黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)为指示菌,发现菌株1628-G抑菌活性比原始菌株1628显著增强,与原始菌株1628相比,菌株1628-G的丰加霉素产量提高了1.77倍,此外,其四烯大环内酯类抗生素的产量也有明显的提高:四霉素A、四霉素P和四烯菌素B分别增加了大约46%、25%、45%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:1628-G中gntr基因在整个发酵过程中表达量都高于原始菌株1628,且涉及丰加霉素合成的基因toyD、toyF和toyM的相对表达量在发酵前期和中期均高于原始菌株1628,而在末期表达水平下降,低于原始菌株。说明蛋白X0P338(GntR)可能是一个全局性的正向调控因子,其不仅影响丰加霉素的合成,也同样参与调控其他次级产物的合成。最后,分别扩增编码蛋白X0MUI0(Crp)、A0A0C2B1U9(IclR)的编码基因crp和iclr,生物信息学比对分析,crp基因与已公布链霉菌中Crp/Fnr家族转录调节子的同源性最高达99%。crp基因过表达的菌株1628-C抑菌活性比原始菌株略高,其丰加霉素产量由原始菌株1628的235.34mg/L增加到265.93mg/L,说明X0MUI0(Crp)可能是丰加霉素生物合成的正向调控因子,但相关性不强。iclr与IclR家族转录调节子拥有98%的同源性,证实其属于IclR家族转录调节子。iclr基因过表达的菌株1628-I的抑菌能力比原始菌株1628略差,发酵测得其丰加霉素产量较原始菌株1628减少50.3%,说明A0A0C2B1U9(IclR)可能是丰加霉素合成的负向调控因子。