路易斯抗原(Lewis/Le antigen)是一类经α1,3-或α1,4-岩藻糖基化修饰的抗原表位决定簇,是细胞表面复杂糖链上常见的结构单元。Lewis抗原相关糖链结构往往与蛋白质或脂质共价连接形成糖蛋白或糖脂,或者以游离寡糖形式存在。通常作为配体或受体介导细胞间、细胞与细胞外环境的相互作用,在许多生理和病理中均发挥着至关重要的作用。例如,Lex抗原是一种阶段特异性胚胎抗原(SSEA-1/CD15),在胚胎发育过程中扮演重要作用。唾液酸化Lewis抗原sLex和sLea作为E-、P-和L-选择素的特异性识别配体,能介导炎症反应中白细胞的转运和外渗等。此外,宿主细胞上的Lewis抗原是各种细菌、病毒和寄生虫感染的受体,许多病原体以分子拟态的方式表达这些抗原,以逃避宿主的免疫监视。很多Lewis抗原还是人乳寡糖(HMOs)的重要结构组成部分,在维持肠道菌群的形成,抵抗病原微生物的感染,免疫调节等方面发挥重要作用。含Lewis抗原的糖链结构复杂多样,10种特征性的Lewis抗原表位决定簇是细胞表面多聚乳糖胺(poly-LacNAc)糖链骨架上常见的结构单元,包括Lex、sLex、Ley、ALey、BLey、Lea、sLea、Leb、ALeb和BLeb。poly-LacNAc 糖链是细胞表面O-聚糖、N-聚糖和糖脂等复杂糖链的基本骨架,是由二糖单元LacNAc(N-acetyllactosamine,Galβ1,4GlcNAc,a type-2 chain)或 LNB(lacto-N-biose,Galβ1,3GlcNAc,atype-1 chain)经β1,3-糖苷键串联而成的线性寡糖。poly-LacNAc糖链通常含有多个α1,3-或α1,4-岩藻糖基化位点,在相应的岩藻糖基转移酶的催化作用下,生成含Lea或Lex抗原表位的结构,Lex和Lea存在于poly-LacNAc糖链骨架的中间和/或非还原末端,其余8种Lewis抗原表位结构均存在于poly-LacNAc糖链的非还原末端,它们是在Lex或Lea结构基础上,由相应α2,3-唾液酸转移酶或α1,2-岩藻糖基转移酶或/和α1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶/α1,3-半乳糖转移酶催化生成。众多具有重要生物学意义的糖链结构上含有位点专一性岩藻糖基化的poly-LacNAc糖链结构,包括各种线性的或多分支对称/不对称的复杂Lewis抗原糖链,为了进一步深入了解和探究位点专一性岩藻糖基化糖链的具体构效关系、相关疾病的分子作用机制等,当前首要的任务是解决高纯度、结构明确的复杂Lewis抗原糖链的获得性问题。从生源提取方面分析,复杂Lewis抗原糖链的生物合成途径是由相应的岩藻糖基转移酶和其他酶协同操控的,是非模板驱动的过程,其产物往往是结构相近、微观异质性的糖链混合物,并且天然丰度较低,因此从生物体内分离提取一定量和结构均一的复杂Lewis抗原糖链是一项极其艰巨的任务。从合成的角度分析,在过去的几十年里,虽然糖科学家们发展了多种化学法、酶法和化学酶法等组装策略,实现了各种Lewis型糖链结构的多样化合成,但是,目前还没有一种通用的方法可以在poly-LacNAc糖链的多个岩藻糖基化位点上精准的引入岩藻糖。究其原因有两点:(1)从化学合成方面分析,首先Lewis相关抗原的合成中涉及到岩藻糖苷和唾液酸苷的构建,它们在酸性条件下相对不稳定,并且α-唾液酸糖苷键的立体选择性难以控制;其次,虽然通过正交保护基介导的化学组装策略也被用来选择性修饰poly-LacNAc糖链中的GlcNAc砌块,之后利用生物酶固有的底物专一性,能够实现位点专一性的岩藻糖基化修饰,或者直接通过化学组装策略实现均一结构Lewis抗原糖链的全合成,但无论是哪种方案,化学合成中涉及到多步繁琐的保护基操作以及分离纯化步骤,耗费大量的人力和时间,这会导致合成产率和效率大大下降,而且需要研究者具备精湛的糖链合成专业知识和操作技能。因此,复杂Lewis抗原糖链的化学合成存在很大的挑战,以上两种策略并不适用于大规模合成以及在更为复杂的糖链骨架上定点精准的引入α1,3-或α1,4-岩藻糖。(2)从酶法合成角度分析,哺乳动物来源的岩藻糖基转移酶具有相对的底物专一性,对某些岩藻糖基化位点有一定的选择性,但是在含有poly-LacNAc糖链的底物上通常只能得到不同程度岩藻糖基化的糖链混合物;而微生物来源的岩藻糖基转移酶的底物识别范围较宽,大多以非位点专一性的方式催化poly-LacNAc糖链骨架的岩藻糖基化,其产物往往同样是不同程度岩藻糖基化的糖链混合物,不能催化合成结构明确的单一 Lewis抗原糖链结构。综合以上因素,要在poly-LacNAc糖链骨架上位点专一性的引入α1.3-或α1,4-岩藻糖依旧存在极大的挑战。为了解决这一问题,本论文创新性地发展了一种具有普适性的合成策略,将有机合成的理念运用到糖链合成的酶促反应中,通过对糖链组装模块的重新编程,将生物体内与α1,3-或α1,4-岩藻糖基化修饰无关的α2,6-唾液酸化模块整合到Lewis抗原糖链的组装线中,运用α2,6-唾液酸化和α1,3/4-岩藻糖糖基化的竞争反应来精准控制poly-LacNAc糖链位点专一性的岩藻糖基化修饰。该策略的关键在于,poly-LacNAc糖链骨架延伸时,在不需要α1,3-或α1,4-岩藻糖基化修饰的乳糖胺(LacNAc/LNB)和乳糖(lactose)单元上使用唾液酸化模块引入α2,6-唾液酸作为“临时保护基”,使其不能被岩藻糖转移酶识别,不被岩藻糖基化修饰,在需要α1,3-或α1,4-岩藻糖基化的LacNAc或LNB单元上直接进行岩藻糖基化修饰,最后,将α2,6-唾液酸保护基用唾液酸苷酶切除,从而实现poly-LacNAc糖链骨架的定点精准岩藻糖基化修饰。本论文主要完成以下几个工作:(1)分别考察了四种糖基转移酶的底物专一性,包括两种岩藻糖转移酶(HpＰ1,3-FucT 和 Hpα1,3/4-FucT),一种唾液酸转移酶(Pd2,6ST)和一种N-乙酰葡萄糖胺转移酶(HpLgtA),创新性的提出了重编程酶法模块化糖链组装策略。(2)运用重编程酶法模块化组装策略,实现了 type 2多聚乳糖胺八糖骨架位点专一性的Ｐ1,3-岩藻糖基化修饰。经合理重编程4个酶法模块并结合最后一步去唾液酸化反应,合成了7个位点专一性的不同程度岩藻糖基化产物,包括3个mono-Lex抗原,3个di-Lex抗原和1个tri-Lex抗原。(3)运用重编程酶法模块化组装策略,实现了 type 1二糖和type 2二糖交替串联的杂合型多聚乳糖胺六糖骨架的位点专一性的Ｐ1,3-或Ｐ1,4-岩藻糖基化修饰。经合理重编程7个酶法模块并结合最后一步去唾液酸化反应,系统性地合成了含有 Lex、Lea、Leb、Ley和 ALey、BLey、ALeb、BLeb 的复杂 Lewis 抗原糖链结构。(4)运用重编程酶法模块化组装策略,实现了更为复杂糖链骨架的位点专一性的α1,3-岩藻糖基化修饰。通过合理运用5个酶法模块和一步去唾液酸化反应,完成了天然产物VIM-2抗原十二糖、唾液酸化di-Lex抗原十三糖和定点岩藻糖基化N-glycan十五糖的合成。本论文的创新点包括以下几个方面:(1)将有机合成的理念、方法和策略引入到寡糖的酶促合成中,创新性地提出了糖链酶法模块化组装的重编程策略,突破了糖链生源合成途径的限制,为复杂Lewis抗原糖链的精准合成提供了首个简洁、高效、普适性的合成策略。(2)运用重编程酶法模块化组装策略,首次实现了α1,3-或α1,4-岩藻糖基化复杂糖链的精准合成。综上,本论文考察了4种来源于细菌的糖基转移酶的底物专一性,发展了糖链组装酶元件的重编程策略,为复杂Lewis抗原糖链的合成提供了首个普适性解决方案。通过合理运用8个酶法组装模块,共合成了 18个结构均一的复杂Lewis抗原糖链,为复杂天然岩藻糖基化寡糖的定性定量分析提供了标准化合物,使得系统性研究这类复杂糖链家族的生物学功能成为可能。