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Bcl-2家族蛋白包括结构同源、功能相反的3个亚族：(1)抗凋亡的Bcl-2-like蛋白,例如Mcl-1蛋白和Bcl-2蛋白；(2)促凋亡蛋白例如Bax和Bak；(3)仅含有BH3结构域的BH3-only蛋白。它们之间通过共同拥有的BH3结构域发生相互作用,调控细胞凋亡。研究证明Mcl-1和Bcl-2蛋白是肿瘤细胞逃避凋亡和获得永生的关键因子,因此成为靶向抗癌药的重要靶点。有机小分子通过占据Bcl-2家族蛋白发生相互作用的界面(interface):BH3沟槽来干扰Bcl-2家族蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用,从而诱导肿瘤细胞凋亡,具有抗癌药成药前景。目前已经有几个Bcl-2抑制剂正处于临床试验阶段；但是特异的Mcl-1蛋白抑制剂还为数很少。因为Mcl-1蛋白的BH3沟槽与Bcl-2的差异明显,现有的Bcl-2抑制剂大多不能同时拮抗Mcl-1蛋白。因此需要通过深入研究小分子与Mcl-1蛋白的结合模式来指导Mcl-1蛋白抑制剂的分子设计和构效关系分析。本文通过二维核磁共振技术(1H-15N HSQC NMR)研究了Mcl-1蛋白与小分子配体的相互作用,揭示了作用位点和结合模式,指导设计了通过扩大结合位点获得更高亲和力的小分子Mcl-1蛋白抑制剂类抗癌先导化合物。首先,我们构建了人源Mcl-1蛋白的表达质粒,通过同位素标记方法,获得15N标记的Mcl-1蛋白。在此过程中,优化了Mcl-1蛋白的表达和分离纯化条件,将15N标记Mcl-1蛋白的表达量从1.3mg提高到7.2mg/L菌体的产量；纯度达到了95%。圆二色谱分析结果显示重组、同位素标记、和纯化的Mcl-1蛋白具有以α螺旋为主的稳定的二级结构。二维核磁共振结果表明各氨基酸残基的谱峰分散均匀,证明15N标记Mcl-1具有稳定的、折叠良好的空间结构,满足小分子核磁滴定试验的要求。接下来,我们对本课题组发现的小分子Mcl-1蛋白抑制剂S1(3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)进行了1H-15N HSQC NMR滴定研究。结果表明,S1引起Mcl-1蛋白化学位移>0.03ppm的氨基酸60%位于BH3沟槽,其中R263残基化学位移改变最为明显。证明S1结合在Mcl-1蛋白的BH3沟槽中。尤其是NMR的结果表明S1主要引起了BH3沟槽的亚活性口袋：p2口袋附近的氨基酸的化学位移,包括V249,M250,V253,R263等残基。计算机辅助分子对接结果体现了S1分子与Mcl-1蛋白的结合模式：S1的羰基与Mcl-1蛋白的R263残基形成氢键,硫吗啉取代基插入Mcl-1蛋白的p2口袋；S1的氰基指向但并未占据Mcl-1蛋白的p4口袋。在这一结合模式的指导下,本课题组合成了小分子H2(3-(4-溴苯硫基-9-3-苯丙胺基-8H-苊并[1,2-b]吡咯-8-酮)和4g(E,E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈),尝试通过延长CN位置的取代基占据p4口袋。最终NMR证明它们与Mcl-1蛋白的结合模式和结合位点：H2和4g均能占据Mcl-1蛋白的BH3沟槽,除了引起和S1相似的p2口袋的氨基酸残基化学位移之外,还引起p4口袋的V216、G219、V220等残基发生明显化学位移,表明它们同时占据了Mcl-1蛋白的p2和p4口袋。