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羊草(Leymus chinensis),属于禾本科赖草属根茎型多年生C3草本植物,因其富含纤维素、半纤维素和可溶性蛋白质等能被草食类牲畜消化吸收的营养成分,被誉为“禾本科牧草之王”。羊草是我国优势牧草和生态草,具有抗寒、耐盐碱、耐贫瘠、耐牧等特点,具有重要经济价值和生态价值。研究发现,牧草细胞壁组分中木质素是牲畜消化吸收营养的重要限制因子。因此,明确羊草细胞壁结构、组分,利用基因工程遗传改造木质素、提高干物质消化率是牧草品质改良的重要研究方向。本实验进行了羊草细胞壁关键组分与糖化效率相关性分析,明确了两者之间的关系;同时克隆了羊草木质素合成关键酶基因COMT的CDS全长,并利用生物信息学对其进行分析;建立了羊草高效离体再生体系和遗传转化体系,构建了羊草木质素合成关键酶基因COMT的超表达载体和RNAi载体,进行了农杆菌介导的羊草愈伤组织遗传转化研究,取得的主要结果如下:1.羊草细胞壁关键组分与糖化效率相关性分析系统分析了羊草细胞壁三大组分的含量变化,发现纤维素和半纤维素在植株发育早期阶段就达到较高水平,随着节间成熟保持稳定状态,而木质素含量及单体成分在整个拔节期茎节中保持显著增加。为了明确羊草木质素合成途径,我们克隆了羊草木质素合成途径的10个关键酶基因片段(CCR,COMT,OMT,PAL,CAD,C3H,HCT,C4H,4CL和F5H),蛋白序列与山羊草、大麦和小麦同源性均在90%以上。其中6个基因(PAL,4CL,HCT,C3H,CCoAOMT和COMT)的表达量在拔节期随着茎的成熟逐渐上调,遵循节间细胞壁木质化模式,5个基因(PAL,C3H,CCoAOMT,COMT和CAD)的表达量在抽穗期随着茎节的成熟保持稳定水平,不遵循节间细胞壁木质化模式。羊草不同器官的细胞壁纤维素酶解糖化效率不同,叶片中糖化效率最高,茎节中糖化效率最低,细胞壁糖化效率与木质素总量、S和G型单体含量以及S/G比率均呈明显的负相关关系,而纤维素含量、木糖含量(代表半纤维素)与细胞壁糖化效率没有相关性。2.羊草LcCOMT基因克隆及体外功能验证克隆获得羊草COMT基因,命名为LcCOMT,该基因ORF全长为1065 bp,编码354个氨基酸、分子量为38.068kDa,等电点为5.62,与大麦、粗山羊草蛋白序列同源性很高,相似性分别为96.11%和95.00%。LcCOMT蛋白为偏疏水蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,包含两个保守的结构域,分别为二聚化结构域与和氧甲基转移酶结构域。LcCOMT基因在叶片、叶鞘和茎节中均有表达,但在茎中表达量最高,且在同一茎节中随着生殖期的延长表达量增加。该基因也能被盐诱导,在200mM NaCl盐胁4 h表达量达到最大。原核表达LcCOMT,进行体外酶活反应,发现LcCOMT完全将反应底物咖啡酰辅酶A(caffeoyl-CoA)转化为产物阿魏酰辅酶A(feruloyl-CoA),具有很高的活性。3.羊草遗传转化体系建立及转LcCOMT基因的初步研究建立了羊草种子高效萌发的方法,种子萌发率达到68.3%;建立了羊草高效离体再生体系,羊草幼穗的出愈率达到90%以上,愈伤组织相对生长率为58.3%,分化率在40%以上;建立了羊草高效遗传转化体系,转化率达到18%以上。构建了LcCOMT超表达(pANIC-6B-OE-LcCOMT)和RNAi(pANIC-8B-RNAi-LcCOMT)载体,遗传转化羊草,PCR检测和GUS染色初步证实了阳性,正在进行后期功能验证。