肝豆状核变性又称Wilson病,是一种常染色体隐性遗传的铜代谢缺陷病,临床上以不同程度的肝细胞损害、脑退行性病变和角膜边缘铜盐沉着环(Kayser-Fleischerring环,K-F环)、急性血管内溶血、肾脏损伤、骨骼损伤为主要临床表现。儿童期肝豆状核变性,以肝病起病最多,但临床上神经系统起病者也并不少见,甚至每个系统都有作为首发症状的报道,这与Deiss的临床分期及Sternlieb的按年龄组的病理分期并不相符,提示不同的临床表型存在更深层次的发病机理。目前认为,肝豆状核变性的病因是ATP7B基因的突变,具有种属和地域性,但基因突变不能完全解释临床表现的多样性。近年来研究认为Apo E的基因多态性与肝豆状核变性的临床表型可能有关。Apo E是一种由299个氨基酸残基组成的脂蛋白转运体,人类Apo E存在三种不同的变异体Apo E2、Apo E3和Apo E4;人类Apo E有3种等位基因形式,产生6种不同的基因型e2/2,e3/3,e4/4,e2/4,e3/4,e2/3。本研究通过给予Apo E基因敲除小鼠铜负荷饮食,建立肝豆状核变性的小鼠模型,观察血清肝功能、血清铜和组织铜在小鼠体内分布,以及铜负荷饮食下小鼠各系统的形态学改变;通过观察Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食下,血清MDA、SOD氧化指标的变化,求证铜负荷饮食是否对小鼠体内氧化应激发生改变;通过对肝脏、脑组织及肾脏组织匀浆氧化指标MDA、SOD的研究,探讨铜负荷饮食对Apo E基因敲除小鼠的影响,深入分析组织铜的分布和氧化应激的关系。观察缺乏Apo E保护之下肝脏和脑组织的氧化指标,试图在动物实验的层面证明,Apo E是否具有一定的神经保护作用以及是否与肝豆状核变性的临床表型有关;另外,通过免疫组织化学、激光共聚焦显微镜及蛋白印迹技术,检测肝脏、脑组织、肾脏组织的NQO1及HO-1的表达,探讨Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食下,肝脑肾脏组织的氧化应激反应的变化机制,并通过RT-PCR方法检测脑组织的NQO1酶的表达,进一步研究Aop E在肝豆状核变性中是否具有神经保护功能。第一部分Apo E基因敲除小鼠铜负荷饮食模型的建立、组织铜分布及形目的:本研究通过给予Apo E基因敲除小鼠及野生型C57BL/6小鼠铜负荷饮食,建立肝豆状核变性的小鼠模型,观察肝功能、血清铜和组织铜在小鼠体内的分布,以及铜负荷饮食下小鼠各系统的形态学改变。方法:Apo E基因敲除小鼠及野生型C57BL/6小鼠铜负荷饮食的模型建立,实验采用4周龄雄性Apo E基因敲除小鼠及野生型C57B/L6小鼠,随机分为如下4组,每组12只。(1)C57B/L6正常饮食组(C组),给予正常饮食;(2)Apo E正常饮食组(A组)(3)C57B/L6+铜负荷饮食组(CC组),给予正常饮食+五水硫酸铜灌胃,200mg/kg(200ppm),0.2ml qd,折合总剂量4mg/d。(4)Apo E基因敲除组+铜负荷饮食组(AC组),给予正常饮食+五水硫酸铜灌胃,200mg/kg 0.2ml qd,折合总剂量4mg/d。正常饮食组同期给予0.9%氯化钠灌胃。干预时间为12周。应用YLS-4C转棒式疲劳仪,通过转棒实验进行行为学测试,反映小鼠的运动协调能力,作为锥体外系症状的指标。于第12周末,从C、A、CC及AC组取12只小鼠,采用断尾法或摘除眼球取血的方法提取血清,应用GEM-9000全自动生化分析仪对血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)进行测定。通过原子吸收法测定血清铜水平以及肝脏、脑、肾脏组织铜含量。取肝脏、脑、肾脏组织石蜡包埋,5μm连续切片,分别用于HE染色、MASSON染色及尼氏染色。通过JEOL JEM-1230型透射电镜行肝脏和脑组织的超微结构观察。结果:(1)野生型和Apo E-KO小鼠给予12周的铜负荷饮食,行为学检测均无统计学差异(P>0.05)。(2)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的血清ALT无统计学差异(P>0.05),不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后血清AST均升高(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的血清AST升高更明显(P<0.01);(3)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肝脏铜累积量有统计学差异(P<0.01),野生型小鼠与Apo E-KO小鼠肝脏铜累积量有差别(P<0.01),给予盐水与硫酸铜干预的小鼠肝脏铜累积量有差别(P<0.01),且基因型和饮食因素之间存在交互作用(P<0.01)。两两比较中,野生型和Apo E-KO小鼠,给予盐水组间肝组织铜无差别(P>0.05);不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肝组织铜均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肝铜累积量更明显(P<0.01)。(4)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的脑组织铜累积量有统计学差异(P<0.01),不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后脑组织铜均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的脑组织铜累积量更明显(P<0.01)。(5)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肾脏组织铜累积量有统计学差异(P<0.01),不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肾脏组织铜均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肾组织铜累积量增加更明显(P<0.01)。野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的血清铜水平无统计学差异(P>0.05)。(6)野生型和Apo E-KO小鼠给予铜负荷饮食,肝脏、脑、肾脏组织形态学对比明显,铜特异性染色阳性细胞数增多,超微结构显示细胞水肿,高电子密度物质增多,线粒体损伤,溶酶体增多,以及胶原纤维增生。结论:Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,肝铜含量明显升高,可作为肝豆状核变性的动物模型;Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,肝脑肾脏组织铜分布遵循饮食铜分布的规律,与野生型小鼠相比,Apo E基因敲除小鼠组织铜水平明显增高;Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,形态学观察有一定的特点,符合铜诱导氧化应激损伤的表现;与野生型小鼠相比,Apo E基因敲除小鼠组织损伤更具有特征性。第二部分Apo E基因敲除小鼠铜饮食诱导氧化应激改变及组织铜分布与氧化应激的关系目的:通过野生型及Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,观察血清MDA、SOD氧化指标的变化,了解饮食铜作为氧化诱导剂,是否对小鼠体内氧化应激发生影响;通过对小鼠肝脏、脑组织及肾脏组织匀浆氧化指标MDA、SOD的研究比较,了解组织内氧化应激的改变;通过探讨铜负荷饮食对野生型及Apo E基因敲除小鼠的影响,深入分析肝脏、脑、肾脏组织铜的分布和氧化应激的关系。方法:血清氧化指标,于第12周从C、A、CC及AC组取12只小鼠,制备血清,检测血清MDA、SOD;组织氧化指标的测定,于第12周随机从C、A、CC及AC组各取3只小鼠,留取肝脏、脑、肾脏组织,组织匀浆,测定组织内MDA和SOD,丙二醛(MDA)测定选择硫代巴比妥酸(TBA)比色法;SOD活性测定选择黄嘌呤氧化酶法。分析铜负荷饮食后野生型和Apo E基因敲除小鼠肝脏、脑、肾脏组织铜的分布及其组织铜与组织氧化指标的相关性分析。结果:(1)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的血清MDA有统计学差异(P<0.01),不论野生型小鼠还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后血清MDA均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的血清MDA增加更明显(P<0.01)。(2)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的血清SOD有统计学差异(P<0.01),不论野生型小鼠还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后血清SOD均降低(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的血清SOD降低更明显(P<0.01)。(3)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肝脏组织MDA有统计学差异(P<0.01),野生型小鼠与Apo E-KO小鼠肝脏组织MDA有差别(P<0.01),给予盐水与硫酸铜干预的肝脏组织MDA有差别(P<0.01),且基因型和饮食因素之间存在交互作用(P<0.01);两两比较中,野生型和Apo E-KO小鼠,给予盐水组间肝脏组织MDA无差别(P>0.05);不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肝脏组织MDA均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肝脏组织MDA增高更明显(P<0.01)。(4)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肝脏SOD有统计学差异(P<0.01),不论野生型小鼠还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肝脏SOD均降低(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肝脏SOD降低更明显(P<0.01)。野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的脑组织MDA和SOD含量无统计学差异(P>0.05)。(5)野生型C57B/L6小鼠,肝组织铜和脑组织铜正相关(r=0.707 P=0.033),血清MDA与血清SOD显示明显负相关(r=-0.775 P=0.014);Apo E基因敲除小鼠,脑组织铜与肾组织铜负相关(r=-0.78 P=0.022);野生型小鼠的血清铜、组织铜及氧化指标之间无相关性;Apo E-KO小鼠给予铜负荷饮食,血清铜水平与血清MDA、血清SOD无相关性;肝组织铜、肾组织铜、血清铜水平均无相关性;肝脏MDA与肾脏MDA正相关(r=0.895.P=0.04);脑组织SOD与肾脏组织SOD负相关(r=0.848.P=0.033)。结论:Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,血清MDA升高及SOD减低,提示铜诱导下机体氧化应激反应增强。肝脏组织MDA的升高及SOD的降低,提示肝脏氧化应激损伤加重,Apo E可能具备肝脏保护作用。Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,脑组织MDA、SOD的变化不明显,与行为学结果一致,Apo E可能不具有神经保护作用。Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,血清、肝脏、脑组织的氧化指标与组织铜的分布无相关性。第三部分Apo E基因敲除小鼠铜饮食诱导肝脑组织氧化应激的机制研究目的:通过免疫组织化学、激光共聚焦显微镜及蛋白印迹技术,检测肝脏、脑组织、肾脏组织的NQO1及HO-1的表达,探讨Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,肝脑肾脏组织的氧化应激反应的变化机制,并通过RT-PCR方法检测脑组织的NQO1酶的表达,进一步研究Aop E在肝豆状核变性中是否具备神经保护功能。方法:通过免疫组织化学法检测肝脏、脑、肾脏组织的NQO1、HO-1的表达,通过激光共聚焦技术检测肝脏及脑组织的NQO1的表达。通过Western Blot法检测肝脏及脑组织HO-1和NQO1的含量。从肝脏及脑组织匀浆中提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度上样,电泳,浓缩胶:80V;分离胶:100V,直到所需marker条带清晰至胶的中部后停止电泳。电泳结束后,使用转移电泳装置,在40C,100V恒压条件下转膜120min,将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h。一抗孵育:封闭液稀释HO-1、NQO1,及actin抗体,然后与封闭好的PVDF膜4℃过夜。二抗孵育:用封闭液稀释相应的二抗,室温下孵育PVDF膜2h。加ECL,曝光、显影,扫取图片并软件分析。通过RT-PCR方法检测脑组织NQO1的表达:脑组织中提取总RNA,鉴定RNA纯度和浓度。应用Oligo(d T)18逆转录试剂盒将RNA逆转录为c DNA。检测扩增变化。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。结果:(1)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肝脏NQO1的表达量有统计学差异(P<0.01),野生型与Apo E-KO小鼠肝脏NQO1的表达量有差别(P<0.01),给予盐水与硫酸铜干预的小鼠肝脏NQO1的表达量量有差别(P<0.01),且基因型和饮食因素之间存在交互作用(P<0.01).两两比较中,野生型和Apo E-KO小鼠,给予盐水组间肝脏NQO1的表达量无差别(P>0.05);不论野生型还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肝脏NQO1的表达量均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肝脏NQO1的表达量更明显(P<0.01)。(2)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的肝脏HO-1的表达有统计学差异(P<0.01),不论野生型小鼠还是Apo E-KO小鼠,给予铜负荷饮食干预后肝脏HO-1的表达均增加(P<0.01);与野生型小鼠相比,给予铜负荷饮食,Apo E-KO小鼠的肝脏HO-1的表达更明显(P<0.01)。(3)野生型小鼠和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的脑组织NQO1的表达量有统计学差异(P<0.01),野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的脑组织NQO1的表达量有统计学差异(P<0.01),野生型与Apo E-KO小鼠脑组织NQO1的表达量有差别(P<0.01),给予盐水与硫酸铜干预的小鼠脑组织NQO1的表达量无差别(P>0.05),且基因型和饮食因素之间不存在交互作用(P>0.05);虽然野生型和Apo E-KO小鼠之间有差别,但给予盐水或铜负荷饮食干预前后NQO1的表达量无统计学差异(P>0.05)。(4)野生型和Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜的脑组织HO-1的表达无统计学差异(P>0.05)。(5)Apo E-KO小鼠给予盐水与硫酸铜脑组织的RT-PCR显示NQO1基因相对表达量无统计学差异(P>0.05)。结论:Apo E基因敲除小鼠给予铜负荷饮食,肝脏组织HO-1、NQO1表达上升,提示饮食铜诱导的氧化应激反应增强,Apo E具有肝脏保护作用。脑组织HO-1、NQO1表达无明显变化,提示Aop E可能不具有肝豆状核变性的神经保护作用。脑组织NQO1的m RNA表达无变化,进一步支持Apo E不是肝豆状核变性的神经保护因素的结论。