论文部分内容阅读
到目前为止,霍乱仍然是许多发展中国家面临的重要公共卫生问题。霍乱弧菌是霍乱的病原菌。1999年在El Tor霍乱弧菌N16961中首先发现了超级整合子(super-integron SI)。SI中除了少数已知的与霍乱弧菌适应性生存有关的基因外,绝大多数基因功能未明。研究提示,不同生物型霍乱弧菌SI的结构变异明显,而不同ElTor霍乱弧菌产毒株之间SI的差异是导致这些菌株之间差异的重要原因。我们采用PCR扫描结合测序的方法研究了60株1961—2008年问我国分离的霍乱弧菌产毒株的SI结构。此外,还使用实时荧光PCR的方法研究了霍乱弧菌N16961的SI中基因在M9培养基、胆盐培养基和AKI培养基中的转录情况,并与LB (luria bertani medium)的转录情况进行了比较。使用BLAST、Artemis Comparison Tool、Clustal W和MEGA 4.0等软件明确了N16961的SI中霍乱弧菌重复序列(Vibrio cholerae repeat sequence VCR)的保守和变异位点,以及VCR和基因盒的构成、分布。在VCR分析基础上,我们分析1961-2008年60株分离自中国19个省、自治区和直辖市的O1 E1 Tor霍乱弧菌产毒株SI的结构特征,绘制了这60个菌株SI内ORF (open reading frame)组成结构图。发现实验菌株SI中大部分基因盒的排列结构具有共线性的特点,但不同流行年代菌株的SI仍具有明显的多样性。多样性的表现形式包括序列插入、序列替换和序列缺失。这些变异很有可能是通过重复序列、VCR之间的重组所介导。60年代和70年代分离菌株的SI的多样性更加明显,而90年代分离菌株的SI的多样性则很低。90年代分离菌株的SI具有标志性的～24kb的片段缺失,提示不同霍乱流行高峰中分离菌株具有特征性的SI结构。实验菌株SI的结构提示,随着霍乱流行年代的变迁,流行菌株的SI结构类型呈现逐渐缩减的趋势。实验菌株中插入基因盒的序列分析提示El Tor产毒株SI基因盒可能来自其它血清群的霍乱弧菌以及拟态弧菌。El Tor产毒株SI结构研究提示,PCR扫描结合片段测序的方法在研究El Tor产毒株SI结构具有有效性。研究结果说明不同霍乱流行中菌株的SI中的基因盒流动持续存在。将N16961在胆盐、M9和AKI培养基中培养,应用实时荧光PCR方法研究Sl内ORF的转录水平。结果显示,与在LB培养基中培养的转录结果相比,在胆盐、AKI培养条件下,少量ORF转录水平出现变化,而M9培养条件下菌株超级整合子中大部分ORF发生转录,并且表现较高的表达水平。其中少数ORF功能已知,这些功能主要集中在代谢和可移动染色体外元件,M9培养条件下还出现与DNA代谢和脂类代谢相关ORF的转录水平增高,可见SI与菌株在低营养状态下的适应性生存密切相关。