荧光定量PCR内参基因的筛选及杜梨HKT基因的克隆和功能鉴定

来源 :南京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hunterfall_horse
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杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.),为蔷薇科梨属落叶乔木,适生性强,在中性土或盐碱土均能正常生长。作为我国的原生树种,杜梨广泛分布于中国华北、华南及西北地区,常被用作梨树的嫁接砧木。HKT(high-affinity K+transporter)蛋白是一种与植物耐盐性相关的Na+转运蛋白或Na+/K+共转运蛋白,在盐胁迫下维持细胞的钠钾离子平衡中起重要作用。本研究在实验室前期对4个杜梨半同胞家系耐盐性研究的基础上,首先筛选了两个适于盐胁迫下杜梨荧光定量PCR的内参基因及其引物,进而采用分子生物学、植物生理学方法对一个盐胁迫响应基因HKT的功能特性进行了研究。主要研究内容如下:1.荧光定量PCR内参基因的筛选。利用杜梨的全基因组注释信息和转录组测序数据,筛选了Actin2(Chr15.g01351)、EF1α-1(Chr3.g19898)、EF1α-2(Chr4.g38173)、EF2(Chr5.g06899)、GAPDH-1(Chr16.g30426)、GAPDH-2(Chr13.g23532)、TUBB(Chr5.g06472)、UBQ(Chr4.g40121)等8个候选基因,设计Actin2、EF1α-1、EF1α-2A、EF1α-2B、EF2、GAPDH-1、GAPDH-2、TUBB-A、TUBB-B、UBQE等10对荧光定量PCR引物,使用delta CT、Best Keeper、ge Norm和Norm Finder等4种评价内参基因稳定性的方法,对10对引物扩增产物的稳定性进行分析,并使用Ref Finder软件对4种评价方法进行综合分析,筛选出了2对适用于盐胁迫杜梨荧光定量PCR的最优内参基因引物(即引物对GΑPDH-1和TUBB-Α),对本研究目标基因HKT(Chr16.g29024)在盐处理下的两种杜梨家系叶片中的表达情况进行分析。本研究同时发现同一基因的不同引物对(即TUBB-Α、TUBB-B和EF1α-2Α、EF1α-2B)其扩增产物的稳定性存在明显差异。2.杜梨HKT基因的克隆和生物信息学分析。以野生型的杜梨叶片为材料,利用拟南芥及其他植物的HKT基因的Trk H结构域,使用5’和3’RACE PCR方法克隆了一个HKT基因,通过与杜梨基因组中HKT的序列比对,发现为编号Chr16.g29024的杜梨基因。该基因序列全长1 614 bp,可编码537个氨基酸;生物信息学分析显示,该HKT基因编码的蛋白含有典型的Tr KH超家族结构域(pfam02386),具有钾离子吸收活性,位于结构域位于编码蛋白质氨基酸的30-40位和175-536处,信号肽分析显示该基因编码的蛋白不存在信号肽;平均疏水性、脂肪系数预测发现该基因编码蛋白质是亲水性蛋白;跨膜结构和二级结构预测表明该HKT基因编码的蛋白具有HKT蛋白典型的8个跨膜结构域和4个膜外的loop序列;其二级结构中无规则卷曲Random coil(Cc)占比最大,其次是延伸链Extended strand(Es),再其次是α-螺旋,不存在β-转角。进化树分析显示杜梨HKT蛋白与山梨、白梨以及苹果在进化上亲缘关系较近,与桃、扁桃、杏、梅、栓皮栎、胡杨、毛果杨、拟南芥、小麦的亲缘关系较远;通过motif分析发现,该杜梨HKT蛋白与已经充分研究的拟南芥HKT相比,既具有共同的motif,也具有梨属自身的特征motif。3.将HKT基因CDS序列与表达载体p Cambia1305连接,构建以35S启动子驱动的组成型表达载体p Cambia1305-HKT,通过农杆菌介导法侵染拟南芥花序进行遗传转化,利用潮霉素抗性筛选、PCR阳性鉴定以及荧光定量PCR法计算表达量,最终获得高表达的转HKT基因阳性植株。在80 mmol/LNa Cl盐胁迫培养基上,转基因拟南芥种子发芽率明显高于野生型(P<0.01)。使用200 mmol/L的Na Cl溶液处理转基因拟南芥与野生型植株后,发现两者叶绿素含量因盐胁迫处理而降低,而丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性因盐胁迫处理呈现增加趋势;在盐胁迫处理后,尽管转基因叶片的叶绿素含量和丙二醛含量与野生型之间没有显著差异,但转基因植株叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性高于野生型。结合盐胁迫处理下种子的萌发率结果,表明HKT转基因拟南芥在盐胁迫下可能优于野生型拟南芥,说明杜梨HKT基因在提高植株耐盐性的功能。
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