背景资料：　　 在胚胎造血发育过程中造血微环境存在一系列变迁，先后经历了由卵黄囊(yolk sac，YS)、主动脉-性腺-中肾区(aorta gonad mesonephros，AGM)、胎肝(fetal liver，FL)到骨髓(bone marrow，BM)的迁移过程。在小鼠胚胎造血发育过程中，卵黄囊血岛是最早的造血位点，胚胎发育7.5(E7.5)天，胚外中胚层来源的内皮和造血细胞共同组成血岛，此时的造血细胞主要是原始红系细胞，并将此时的卵黄囊造血定义为“原始造血(primitive hematopoiesis)”，与之相对应的为“永久造血(definitive hematopoiesis)”。关于永久造血的发生位点目前还未明确，一般认为有两个，分别为AGM区和YS，前者在E10天生成造血干细胞(1,2)(hematopoietic stem cell，HSC)，E11.5天后者也可生成HSC，但由于此时血循环已建立，因此不能排除卵黄囊的HSC来源于AGM。　　 卵黄囊原始造血为红系造血，历时短暂；之后的AGM区开始产生成体造血干细胞，而且此类细胞有多谱系分化潜能，但是，该区却未发现造血分化的痕迹，因此认为AGM区为生血而非造血位点。E11天，HSC通过比较完善的血液循环迁移至胎肝；E13天时，胎肝成为主要造血场所。胎肝造血干细胞相比YS和AGM区功能更趋完善，一方面，具有很强的增殖潜能，另一方面，它可以向髓系和淋巴系分化，其中，胎肝造血微环境在造血发育中发挥了重要的调节作用。胎肝具有永久重建造血的功能，因此认为其为胚胎造血的重要组成部分(3,4)。　　 由既往研究发现，造血位点的迁移以及HSC增殖分化所涉及的调控基因众多，如血管内皮生长因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor)、BMP、Runx1、Ras、Wnt3a、Cdx和Hox等，但是机制尚未明确。VEGF家族有6个成员：VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及PLGF，研究最多的为VEGF和PLGF；VEGF受体家族有三个成员，分别为flk-1、flt-1以及flt-4，前两者主要与血管和造血发育相关，而且它们有一个共同抑制剂SU-5416，flt-4与淋巴管发育相关，非本课题研究要点。VEGF与受体flk-1和flt-1均可结合，而PLGF只与后者发生特异性结合，AKT是VEGF和PLGF信号通路中调控增殖的重要信号分子。曾有研究报道，将胚胎的VEGF或其受体基因敲除后可导致早期造血细胞发育缺陷；而骨髓造血受到抑制时，利用PLGF刺激flt-1表达上调可以使造血系统恢复功能。在造血干细胞表面既有flk-1的表达，亦有flt-1的表达，但是关于VEGF、PLGF如何通过相应受体调控胎肝造血干细胞(FL-HSCs)自我更新和分化的研究却很少，而二者联合使用所起作用更是未曾发现报道。因此若能通过研究胎肝造血，并实现HSC的有效体外扩增，将为白血病、造血系统和免疫系统功能障碍等疾病疾病患者的治疗带来福音。　　 目的：　　 胚胎造血干细胞具有很强的自我复制和增殖潜能，但是体外培养时仍然极易分化，因此，若能找到其增殖分化的有效调控因素，以实现高效、大量获得此类细胞，将有重要意义。VEGF与受体flk-1和flt-1均可结合，而PLGF只与后者发生特异性结合。研究发现，将胚胎的VEGF或其受体基因敲除后可导致早期造血细胞发育缺陷，从而引起胚胎死亡，因此推测VEGF是造血发育的一个重要调控因子；而骨髓造血受到抑制时，利用PLGF刺激flt-1表达上调可以使造血系统恢复功能，故PLGF对造血也具有一定的调控作用，但是机制均未明确。本研究主要观察VEGF以及PLGF激活受体启动信号通路后对FL-HSCs自我更新和分化的影响，并观察二者作用的差异以及联合使用时所产生的效应。　　 方法：　　 取E12天小鼠胚胎，利用其肝脏制备单细胞悬液，将细胞培养48小时后，通过MTT比色法观察VEGF、PLGF以及二者联合使用对胎肝造血细胞存活和增殖的影响，应用流式细胞技术来检测造血干细胞和造血祖细胞的标志物Sca-1和CD34，分析VEGF、PLGF以及二者联合使用对干、祖细胞的支持和增殖作用，此外通过检测细胞周期来观察处理因素对细胞周期的影响。上述实验分组相同，包括对照组(C组)、SU-5416组(S组)、VEGF组(V组)、PLGF组(P组)、“VEGF+PLGF”组(PV组)。通过CFU-GM(colony-forming unit-granulocyte/macrophage，粒-巨噬细胞集落形成单位)分析观察SU-5416阻断VEGF后对造血祖细胞增殖的影响，分组如下：对照组(C组)、SU-5416组(S组)、VEGF组(V组)、“VEGF+SU-5416”组(VS组)；观察SU-5416阻断PLGF后对造血祖细胞增殖的影响，分组如下：对照组(C组)、SU-5416组(S组)、PLGF组(P组)、“PLGF+SU-5416”组(PS组)；观察VEGF和PLGF共同作用对造血祖细胞增殖的影响，分组如下：对照组(C组)、SU-5416组(S组)、VEGF组(V组)、PLGF组(P组)、“VEGF+PLGF”组(PV组)。计数时以肉眼可见的细胞团(含50个以上细胞)作为计数集落的标准，每组集落产量均为接种8万个细胞所得。应用Western-Blot技术检测VEGF、PLGF对胎肝造血干细胞增殖的调控是否通过AKT介导，分组如下：对照组(C组)、SU-5416组(S组)、VEGF组(V组)、PLGF组(P组)、“VEGF+PLGF”组(PV组)。　　 所有数据均用mean±SD表示，用SPSS软件对数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，*P＜0.05时表示差异有统计学意义。　　 结果：　　 集落产率如下：C组38.5±4.65，V组60±13.54，S组20.5±3.7，VS组19.75±4.5，两两比较，V组为S组的292％，V组为VS组的304％，VS组为S组的96.3％，经方差分析，V组与S、VS组均具有显著性差异，而VS和S组差异无统计学意义，因此推测VEGF能够促进造血祖细胞得增殖，而且这个作用可被SU-5416阻断。SU-5416亦可阻断PLGF促进造血祖细胞增殖的作用，结果如下：C组51.667±5.96，P组80.33±8.32，S组39.5±21.95，PS组46.33±11.31，两两比较后，P组为S组的203％，P组为PS组的173％，PS组为S组的117％，经方差分析，P组与S、PS组均具有显著性差异，PS组和S组差异无统计学意义。此外，VEGF促进造血祖细胞增殖的作用大于PLGF，但是二者联合使用却无协同效应，结果如下：C组35.9±4.27，V组5l±5.82，S组29.6±5.46，P组39.2±7.52，PV组39.1±5.06，两两比较发现，V组为P组的130％；V组为PV组的130％，P组为PV的102％，经方差分析，V组与P组间具有显著性差异；V组与PV组间具有显著性差异，P组与PV组差异无统计学意义。　　 利用流式细胞技术所检测表面标志的结果如下：CD34阳性率分别为，C组1.97％，V组5.89％，S组2.08％，P组4.78％，PV组3.81％，两两比较，V组为S组的283％，P组为S组的229％，PV组为S组的183％；V组为P组的123％，V组为PV组的154％；P组为PV组的125％；　　 Sca-1阳性率如下，C组5.22％，V组2.25％，S组1.73％，P组4.67％，PV组5.76％，两两比较发现，V组为S组的130％，P组为S组的269％，PV组为S组的332％；P组为V组的207％；PV组为V组的256％，PV组为P组的123％。　　 处于S期的细胞所占百分比分别为C组7.03％，V组8.76％，S组8.38％，P组7.33％，PV组7.38％。各组差异并不明显。　　 通过MTT比色法分析VEGF和PLGF以及二者联合使用对胎肝造血细胞存活和增殖的影响，结果发现VEGF可促进胎肝造血细胞的增殖，结果如下：490nm处吸光度C组为0.427±0.101，V组为0.462±0.098，S组为0.398±0.141，P组为0.433±0.141，PV组为0.445±0.202，进行比较，V组为S组的118％，P组为S组的111％，PV组为S组的115％，经方差分析，V组和S组差异有统计学意义，其他各组组间差异无统计学意义。　　 将Western-Blot结果进行灰度值分析，并将各组灰度值与S组相比，结果如下C组0.628，V组1.105，S组1，P组1.158，PV组0.428，其中V组为S组的110％，P组为S组的115％，PV组为S组的42％。　　 结论：VEGF和PLGF激活受体信号后均可促进造血细胞的体外存活和增殖分化。VEGF可促进胎肝造血祖细胞数量的扩增使CFU-GM的产率增加，并且此作用大于PLGF；PLGF则更有利于造血干细胞的体外维持和扩增。VEGF与PLGF联合使用对胎肝造血祖细胞的扩增无协同效应；两者联合使用对FL-HSCs的自我更新具有协同作用。SU-5416通过阻断flk-1和flt-1后，能够有效抑制胎肝造血细胞的增殖。在VEGF和PLGF激活的通路中，AKT参于了对造血细胞增殖的调控。