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纤毛是细胞生命活动中的重要的器官,原生纤毛能够调控由外界物理和生物化学变化引起的各种信号转导,纤毛的缺陷能够导致各种疾病,例如视网膜变性、多囊肾病、神经管缺陷等,因而研究纤毛的结构、运动、生理过程和功能有着非常重要的意义。双鞭毛莱氏衣藻是研究纤毛的重要的模式生物,莱氏衣藻的配子交配过程需要经过复杂的信号转导级联反应来完成。在这个级联反应过程中,配子鞭毛表面的凝集素促使细胞内水平的cAMP增加,随即使细胞发生一系列变化、激活配子、完成细胞融合前奏的生理过程。其中,能够将ATP转变为cAMP的腺苷酸环化酶AC,在由配子粘附诱导产生的整个信号转导通路中起关键作用。因此,本文研究了第三类腺苷酸环化酶CrAC3,检测和分析了其蛋白质在莱氏衣藻中的表达和功能。主要研究结果如下:1.利用JGI基因组数据库（Chlamydomonas version4.0）,筛选出莱氏衣藻第三类腺苷酸环化酶CrAC3,编码1391个氨基酸,其转录基因的表达具有配子特异性;通过生物信息学分析,CrAC3是包含六个跨膜螺旋的疏水性膜蛋白,预测大小为180 KD,包含磷酸化和糖基化修饰位点;CrAC3与已报道的鞭毛生物草履虫、四膜虫和恶性疟原虫中AC蛋白质序列高度相似,都包含了离子通道结构。该结果为研究CrAC3蛋白质检测分析提供了基础。2.利用转基因技术,将带有选择性基因APHⅧ、C-末端HA标记、外源启动子RBCS-HSP70驱动的构建体基因CrAC3-HA-RBCS转入莱氏衣藻细胞中,筛选出转化细胞S11（mt-）。利用免疫荧光、蛋白印迹法结合Rat anti-HA抗体检测表明,蛋白质CrAC3-HA-RBCS表达于S11（mt-）配子细胞、激活的配子中,且都集中表达于鞭毛中,但编码CrAC3-HA-RBCS基因表达的蛋白质大小为75 KD,即构建体基因CrAC3-HA-RBCS可能在细胞内被剪切。该研究结果为比较内源蛋白质CrAC3、转化蛋白质CrAC3-HA-RBCS在莱氏衣藻配子中的表达和相关功能提供了依据。3.利用莱氏衣藻细胞杂交技术,获得编码蛋白质CrAC3-HA-RBCS的fla10细胞C-16（mt+）。利用蛋白印迹法和Rat anti-HA抗体检测,揭示出C-16（mt+）细胞中蛋白质CrAC3-HA-RBCS的表达类似于S11（mt-）,也大量表达在C-16（mt+）配子鞭毛中。该结果说明S11（mt-）细胞中编码CrAC3-HA-RBCS基因能够通过杂交而遗传,该结果为研究蛋白质CrAC3-HA-RBCS的遗传、在细胞中的移动和功能提供了根据。4.利用莱氏衣藻突变体细胞fl10（mt+）及杂交细胞C-16（mt+）,结合非正常温度培养、蛋白质印迹法、Ratanti-HA抗体,检测出蛋白质CrAC3-HA-RBCS在C-16（mt+）配子细胞中发生了从鞭毛到细胞体的移位现象。再利用IFT蛋白运输系统中主要蛋白质复合物A与B的抗体检测,揭示出IFT蛋白质复合A与B具有与CrAC3-HA-RBCS相同的变化规律。因此,推测蛋白质CrAC3-HA-RBCS在C-16（mt+）配子细胞体及鞭毛中的表达变化与IFT蛋白质运输系统相关联,即CrAC3-HA-RBCS的移位借助了 IFT运输系统。5.采用单克隆抗体技术,并结合蛋白印迹法和单克隆抗体检测,筛选出了抗莱氏衣藻 CrAC3 肽的单克隆抗体 1J11110824,1J11<sub>110824 在 6145C（mt-）和 S11（mt-）配子鞭毛中识别的靶蛋白质为180KD,符合CrAC3的预测大小。进一步提取S11（mt-）与21gr（mt+）在不同交配时间中的鞭毛,利用1J11110824检测得到的蛋白质CrAC3在鞭毛中的表达规律,与用Rat anti-HA抗体检测出的蛋白质CrAC3-HA-RBCS的表达规律相同。这一结果不仅明确了 CrAC3及CrAC3-HA-RBCS蛋白质的抗体,也为下一步研究这两种蛋白质提供了工具。6.利用莱氏衣藻CrAC3的BAC基因,构建了内源启动子驱动的莱氏衣藻CrAC3标记基因CrAC3-HA-endo,并将其转入莱氏衣藻突变体fla10细胞中,筛选出了编码基因CrAC3-HA-endo的转化细胞。该结果为下一步将单克隆抗体1J111110824与CrAC3-HA-endo相结合,研究CrAC3-HA-endo在莱氏衣藻细胞中的表达、对配子激活的影响和合子的形成提供了基础。