论文部分内容阅读
苯乳酸(PLA)是一种新型生物防腐剂，乳酸脱氢酶(LDH)是乳酸菌(LAB)中转化苯丙酮酸(PPA)生成苯乳酸的主要酶。根据已知的植物乳杆菌WCFS1全基因组序列可知，植物乳杆菌有三个乳酸脱氢酶基因，分别为ldhL1、ldhL2、ldhD，三个基因的酶产物分别为：L1-乳酸脱氢酶、L2-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶。
本研究根据L.plantarum WCFS1的三个乳酸脱氢酶基因设计引物，并以植物乳杆菌SK002全基因组DNA为模版，PCR扩增并连接到pMD-19简易T载体。测序结果表明：植物乳杆菌SK002 ldhL1基因长度为963 bp； ldhD(Gene bank登录号FJ712706)基因长度为999 bp；ldhL2基因长度为930 bp。将三个基因连入表达载体，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中，成功诱导表达并纯化出三种重组乳酸脱氢酶。三种酶的蛋白分子量分别为35、34、40 kDa。测定三种重组酶对底物苯丙酮酸的活性，发现:L2-LDH对苯丙酮酸的比活力仅为0.06U/mg； L1-LDH为71.06 U/mg，是L2-LDH的1000多倍；D-LDH比活力为215.84 U/mg。故重点研究L1-LDH和D-LDH的酶学性质。L1-LDH酶活测定的最适pH为6.0，温度为40℃:D-LDH最适pH为6.0，温度为30℃；L1-LDH的pH稳定性及热稳定性均好于D-LDH。在各自的最适测定酶活条件下，测定两种酶对丙酮酸及苯丙酮酸的Km。L1-LDH对丙酮酸及苯丙酮酸Km分别为0.23、3.96 mM；D-LDH对丙酮酸及苯丙酮酸Km分别为0.06、5.4 mM。