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在世界范围内,大肠癌是危害人类健康的常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均占第二位,并呈现逐年上升趋势。近年来,细胞内信号传导通路异常与肿瘤发生发展的关系成为医学界研究的热点问题。IGFBP4(Insulin Like Growth Factor Binding Protein 4),即胰岛素样生长因子结合蛋白4,是一种分泌型蛋白,其在多种正常组织中均有表达,但在大部分肿瘤中呈低表达,如肾癌、大肠癌、乳腺癌等。IGFBP4可通过调控IGFs信号系统和其它信号系统,影响细胞的增长,但后者鲜见报道。有研究发现,IGFBP4可以通过与Wnt受体Frizzled8(Frz8)竞争性结合,抑制Wnt与其受体结合活性,从而使经典Wnt/β-catenin信号通路失活;在肾癌中IGFBP4也可以通过调控经典Wnt/β-catenin信号通路而发挥作用,但在大肠癌中未见报道。目前研究已经表明Wnt/β-catenin信号通路是结直肠癌发生发展的重要机制之一,而该通路的异常激活可以介导大肠腺瘤的癌变。本课题组在前期病理组织学水平研究发现,IGFBP4蛋白表达水平在大肠正常粘膜、异型增生管状腺瘤和腺癌中依次降低,并与Wnt/β-catenin信号通路相关因子呈负相关,提示IGFBP4与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定的调控作用,因此为进一步探讨IGFBP4与Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及机制,本实验选取大肠癌细胞株,采用体外细胞培养技术、质粒转染技术、Real time-PCR及Western blot方法,在细胞水平上探讨在大肠癌细胞中IGFBP4是否对经典Wnt/β-catenin信号通路发挥调控作用,进而为大肠癌的发生发展机制提供新的思路。目的:在细胞水平上探讨IGFBP4对经典Wnt/β-catenin信号通路发挥怎样的调控作用方法:1细胞培养选择两株人结肠癌细胞株(HT-29和HCT116)进行体外培养。HT-29和HCT116细胞分别用含10%胎牛血清配以105 U/L青霉素、100mg/L链霉素的Mc Coy′s 5A培养基和含10%胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基培养,细胞贴壁生长。2质粒转染实验靶细胞的筛选HCT116和HT-29细胞分别于对数生长期给予0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化并收集细胞。应用Western blot技术分别对两株人结肠癌细胞中IGFBP4的蛋白表达进行检测,筛选低表达IGFBP4的细胞株作为实验后续研究的靶细胞。3质粒转染构建人IGFBP4基因的M90载体质粒,瞬时转染人类结肠癌细胞株HCT116,同时转染空载质粒作为阴性对照。分别检测IGFBP4基因上调后对Wnt/β-catenin信号通路上的相关因子Wnt2、Frizzled8、β-catenin、TCF-4、CDK2及Cyclin B1的影响。4蛋白免疫印记(Western blot)转染处理HCT116细胞48h后,提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹法检测转染处理后人类结肠癌细胞株HCT116中IGFBP4及Wnt/β-catenin信号通路上相关因子的蛋白表达情况,采用Odyssey仪器进行显色分析,Bio-LD图像分析系统进行定量分析。5 Real time-PCR转染处理HCT116细胞48h后,应用Real time-PCR检测HCT116细胞中IGFBP4的m RNA水平,采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法计算,计算目的基因相对表达量。6统计学分析应用SPSS Statistics19.0软件,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果:1筛选低表达IGFBP4的人类结肠癌细胞株对HCT116和HT-29人结肠癌细胞中IGFBP4的蛋白表达情况进行检测,结果发现这两株细胞均表达IGFBP4,但HCT116细胞IGFBP4表达水平最低。因此,选择HCT116细胞作为本实验的研究对象。2质粒转染效率的检测于转染48小时后收集细胞,通过绿色荧光蛋白GFP检测细胞转染效率。3 IGFBP4质粒转染后对其自身m RNA和蛋白的表达情况Real-time PCR结果显示,与NC质粒对照组相比,IGFBP4的表达在HCT116细胞IGFBP4质粒转染组中显著升高。Western blot结果同样表明,IGFBP4蛋白的表达在IGFBP4质粒转染组明显高于NC对照组细胞。以上结果表明所用IGFBP4质粒可以有效上调IGFBP4的表达。4 IGFBP4对体外培养HCT116细胞Wnt/β-catenin信号通路表达的影响4.1 IGFBP4质粒干扰对体外培养HCT116细胞Wnt2和Frizzled8表达的影响于转染48小时后收集细胞,检测IGFBP4质粒干扰对体外培养HCT116细胞内Wnt2和Frizzled8的影响。Western blot结果显示,与NC对照组相比,Wnt2和Frizzled8蛋白的表达水平在IGFBP4转染组没有明显变化(P>0.05);提示IGFBP4不参与调控Wnt2和Frizzled8的表达。4.2 IGFBP4质粒干扰对信号通路相关分子β-catenin、TCF-4、CDK2及Cyclin B1表达的影响程度于转染48小时后收集细胞,检测IGFBP4质粒干扰对信号通路下游分子β-catenin、TCF-4、CDK2及Cyclin B1的影响程度。Western blot结果显示,与NC对照组相比,β-catenin、TCF-4、CDK2及Cyclin B1的蛋白的表达水平均有所降低(P<0.05),提示IGFBP4可以调控β-catenin、TCF-4、CDK2及Cyclin B1的表达。结论:IGFBP4可明显下调β-catenin及其通路下游因子的蛋白水平,提示IGFBP4负性调节Wnt/β-catenin信号转导通路。