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目的:探索程序性坏死在三氯化铝致斑马鱼认知功能障碍中的作用,以及Caspase-8基因是否在程序性坏死中起着关键的调控作用。方法:选择健康野生型Tu品系斑马鱼,购买于武汉国家斑马鱼资源中心,饲养在斑马鱼养殖系统中。温度控制在(28±0.2)℃,光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h,将PH调至7.2,电导率为500-550(μS/cm),每天规律喂食孵化出的丰年虾两次。选取同一批次6月龄健康成年斑马鱼,随机分为四个组,每组设置30条斑马鱼成鱼。分为对照组,对照+Nec-1组,三氯化铝组(200μg/L),三氯化铝+Nec-1组(Nec-1浓度为15μmoL/L),将每组PH使用稀盐酸调节至6.4,加入0.05%的DMSO。染毒结束后,通过斑马鱼成鱼T迷宫实验检测斑马鱼学习记忆能力;通过检测斑马鱼成鱼脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和活性氧(ROS)水平判断斑马鱼脑组织氧化应激水平;通过HE染色、尼氏染色和电镜实验判断斑马鱼脑组织形态结构和病理学改变;通过检测斑马鱼脑组织程序性坏死相关基因判断斑马鱼脑组织神经细胞死亡方式;通过免疫组化实验检测RIP1和Caspase-8蛋白在斑马鱼脑组织的表达情况。幼鱼实验:将受精6小时(hpf)的斑马鱼胚胎分成2个大组,分别为不加Caspase-8特异性抑制剂氟甲基酮(Z-IETD-FMK)组和加Caspase-8特异性抑制剂组(4mmoL/L),以观察Caspase-8对斑马鱼胚胎和幼鱼的一般毒性和神经行为的影响。不加Caspase-8特异性抑制剂组又分为对照组和三氯化铝组(200mg/L),将每组PH使用稀盐酸调节至6.4。加Caspase-8特异性抑制剂组又分为对照组,对照+Nec-1组,三氯化铝组和三氯化铝+Nec-1组,将每组PH使用稀盐酸调节至6.4,加入0.05%的DMSO,以观察Caspase-8在程序性坏死中的作用。结果:1.斑马鱼成鱼T迷宫实验:与对照组相比,三氯化铝组第三、四天潜伏期延长,具有统计学意义(P<0.05),三氯化铝+Nec-1组第二天潜伏期缩短,具有统计学意义(P<0.05);三氯化铝组第一天、第四天累计停留时间缩短,具有统计学意义(P<0.05);与三氯化铝组相比,三氯化铝+Nec-1组第二、三、四天潜伏期缩短,具有统计学意义(P<0.05);三氯化铝+Nec-1组第四天累计停留时间延长,具有统计学意义(P<0.05)。2.斑马鱼成鱼脑组织氧化应激水平检测:与对照组相比,三氯化铝组SOD和LDH活力降低,ROS的水平增高,具有统计学意义(P<0.05),加入Nec-1后,三氯化铝组比对照组的SOD和LDH的活力略微降低,ROS的水平升高,具有统计学意义(P<0.05),但是比不加Nec-1的三氯化铝组的SOD和LDH的活力升高,且ROS的水平降低,具有统计学意义(P<0.05)。3.斑马鱼成鱼脑组织形态和病理学检测:HE染色结果显示,对照组斑马鱼成鱼端脑结构完整,细胞结构正常,分布集中,细胞核大而圆,周围可见少量胞质,三氯化铝组可见明显的炎症浸润,细胞体积水肿增大,周围可见许多体积不规则的细胞和细胞核凝固的死亡细胞。加入Nec-1以后,对照组细胞无明显变化,而三氯化铝组端脑神经细胞明显好转,细胞结构正常,分布均匀,炎症浸润情况好转,水肿细胞减少。尼氏染色结果显示,三氯化铝组比对照组细胞数量明显减少,加入Nec-1后,三氯化铝组细胞数目明显增多,虽仍少于对照组神经细胞的数量,但高于不加Nec-1的三氯化铝组。透射电镜结果发现,对照组细胞形态结构完整,细胞核膜完整,线粒体,高尔基体,内质网等细胞器清晰可见;而三氯化铝组细胞核凝聚成不规则形,线粒体肿胀、破裂,细胞中其余细胞器消失,细胞周围出现空泡。加入Nec-1以后,对照组细胞无明显变化,三氯化铝组可见细胞结构完整,线粒体,内质网,高尔基体等细胞器均存在,但是细胞质中仍有肿胀的囊泡。4.斑马鱼成鱼脑组织程序性坏死相关基因表达水平:三氯化铝组RIP1、RIP3、Caspase-3、Caspase-9、FADD基因表达升高,而Caspase-8基因表达降低;加入Nec-1以后,三氯化铝+Nec-1组RIP1、RIP3、Caspase-3、Caspase-9比不加Nec-1的三氯化铝组基因表达水平降低,而Caspase-8基因表达水平升高,具有统计学意义(P<0.05)。5.斑马鱼成鱼脑组织免疫组化结果:三氯化铝组斑马鱼端脑RIP1蛋白表达增加,Caspaes-8蛋白降低,具有统计学意义(P<0.05),加入Nec-1以后,三氯化铝组RIP1蛋白表达降低,而Caspaes-8蛋白表达升高。6.斑马鱼幼鱼相关实验结果:与Caspase-8未抑制的对照组相比,Caspase-8抑制的对照组、三氯化铝组和三氯化铝+Nec-1组斑马鱼幼鱼累计死亡率和畸形率升高,孵化率降低,具有统计学意义(P<0.05),与Caspase-8未抑制的三氯化铝组相比,Caspase-8抑制的对照+Nec-1组、三氯化铝+Nec-1组斑马鱼幼鱼累计死亡率、畸形率降低,孵化率升高,具有统计学意义(P<0.05),Caspase-8抑制三氯化铝组幼鱼累计死亡率、畸形率升高,孵化率降低,具有统计学意义(P<0.05);观察斑马鱼24h鱼卵和第6天形态发现,正常组斑马鱼鱼卵发育状况良好,6天后发育成正常的斑马鱼幼鱼,Caspase-8抑制的正常组斑马鱼卵在24h出现了水肿的情况,6天后也出现了心包水肿;与Caspase-8未抑制的对照组相比,Caspase-8抑制的对照组,对照+Nec-1组、三氯化铝组和三氯化铝+Nec-1组斑马鱼幼鱼自发运动平均速度降低和移动距离减少;斑马鱼惊恐逃避反射实验结果表明,各组幼鱼在光照期速度均明显降低,与Caspase-8未抑制的对照组相比,Caspase-8抑制的对照组、三氯化铝组、三氯化铝+Nec-1组速度明显降低,具有统计学意义(P<0.05);与Caspase-8未抑制的对照组相比,Caspase-8抑制的对照组、三氯化铝组、三氯化铝+Nec-1组SOD和LDH活性降低,而ROS的荧光强度增高;RT-PCR实验发现,与Caspase-8未抑制对照组相比,Caspase-8抑制的对照组、对照+Nec-1组、三氯化铝组和三氯化铝+Nec-1组RIP1、RIP3、Caspase-3、Caspase-9、FADD表达升高,Caspase-8基因表达降低。结论:1.三氯化铝导致斑马鱼发生认知功能障碍,主要原因是神经细胞死亡增加;2.三氯化铝导致神经细胞死亡方式中有程序性坏死的存在;3.Caspase-8基因在三氯化铝致斑马鱼程序性坏死中起着关键的调控作用;4.抑制斑马鱼幼鱼Caspase-8基因后,斑马鱼幼鱼的运动能力下降,氧化应激水平升高。