论文部分内容阅读
研究目标:PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活会导致一系列复杂疾病的发生,这其中包括2型糖尿病和癌症。Notch基因在肝脏发育过程中起着关键作用,是胆道分化所必需的。有证据显示,AKT和Notch信号在人类肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma,ICC)临床样本中异常激活的比例大于50%。此外,有动物实验证明,AKT可以协同其它癌基因驱动ICC的发生,Notch过表达也能诱发ICC。但这两者在ICC中的作用和分子机制还未被阐明。更重要的是,在前期的研究中,我们得知AKT诱导的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)小鼠模型极其依赖于内源性脂肪合成途径,相反地,AKT/NICD(Notch核内片段)诱导的ICC小鼠模型不需要内源性脂肪的合成。我们推测,ICC这种不同于HCC的代谢途径的改变有可能是Notch作用于AKT信号的结果,但还需进行验证。因此,本研究将在动物模型中研究两种信号通路在ICC中的相互作用和分子机制,同时也将对肝内胆管癌的代谢途径进行初步探索。研究方法:本研究中,我们利用实验室独特的造模方法——高压尾静脉注射原癌基因质粒,成功构建了AKT1/NICD1诱导的ICC小鼠模型。在此模型中,我们首先验证AKT在ICC中是否调控mTORC1复合物,我们在敲除RAPTOR(mTORC1重要复合物)后观察小鼠的状态,收取肝脏组织进行免疫组化、Western Blotting和qRT-PCR检验敲除效果和通路表达情况。此外,我们还用mTORC1靶向抑制剂雷帕霉素对ICC小鼠进行给药,然后同样用免疫组化、Western Blotting和qRT-PCR等方法对其阻断和治疗ICC的作用进行研究。其次,为了研究ICC脂肪合成途径的时间节点,我们收取了ICC小鼠早期的组织进行免疫组化和油红O染色,并检测了ICC细胞对外源脂肪酸的摄取。最后,为进一步探索Notch是通过什么分子机制抑制脂肪合成以及AKT在ICC中的作用,我们用WT、AKT和AKT/NICD小鼠进行了转录组测序,利用统计学方法分析Notch和AKT信号通路在ICC中的下游靶点。研究结果:首先通过在ICC小鼠中敲除RAPTOR,我们发现mTORC1缺失对ICC的发生发展有显著抑制效果,此外,我们检测到组织中脂肪合成途径相关蛋白表达水平很低,说明AKT在ICC中调控mTORC1,但不激活内源性脂肪合成。其次,我们用雷帕霉素对ICC小鼠早期给药后,肝脏肿瘤结节明显减少,ICC很大程度上被抑制生长,但晚期给药时,对恶性ICC的治疗作用非常有限。所以我们在体外用AKT/mTOR和Notch抑制剂联合用药,发现人ICC细胞生长受到显著抑制。重要地是,我们仍然检测到组织中脂肪合成途径相关蛋白表达水平很低,与之前的结果一致。接着,我们证明了在ICC早期脂肪合成途径表达很低,没有脂滴积累。此外,我们发现与HCC细胞相比,ICC细胞对外源脂肪酸有强大的摄取能力,并且这一过程依赖于脂肪酸转运蛋白。最后,我们通过转录组数据分析发现,ICC中细胞周期和增殖信号上调和糖代谢途径下调共同促进了肿瘤发展,我们后续将对筛选到的靶点进行验证。综上所述,本研究证明了AKT/mTORC1和Notch信号通路对ICC的发生发展具有驱动作用,有望成为治疗ICC的靶点,并在此过程中初步探索了ICC的代谢特征。研究结论:首先,在ICC中,AKT信号通过激活mTORC1促进肿瘤发生发展,但与此同时mTORC1却不调控内源性脂肪合成,而是通过某种激酶途径促进细胞的增殖与生长来加速ICC的发展进程。其次,ICC代谢特征不遵循Warburg效应——ICC中糖酵解途径表达下调,使得肿瘤细胞无法获得足够的原料合成内源性脂肪来满足自身增殖需求,从而只能依赖摄取外源性脂肪酸来用于生命活动。创新点:本研究揭示了肝内胆管癌不同于肝细胞肝癌的代谢特点——不遵循Warburg效应。这很有可能代表了一种非经典肿瘤异常脂代谢途径,从而成为对现有肿瘤代谢研究理论的有益补充。