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急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是临床常见的危重症,尽管近年来治疗手段有所发展,然而病死率仍较高[1-3]。有关ALI/ARDS的发病机制目前尚未完全阐明,但是目前认为炎症反应失衡在其发生发展过程中起着关键作用,而有关炎性细胞因子产生释放机制目前仍未完全阐明。白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是ALI/ARDS发展过程中较为重要的炎性介质,目前研究表明,IL-1β、IL-18的产生受NLRP3炎症体通路的调控[4,5]。NLRP3炎症体是细胞质内的多蛋白复合体,其组件包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase1)共同组成[6]。其可以识别多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs),比如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或者损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs),比如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),从而由静止形式转变为活化形式,进而促进IL-1β和IL-18释放[7]。研究表明肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞中存在NLRP3炎症体通路,且其活化以后参与了ALI的发生发展[8,9],然而在肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AEC)是否也存在NLRP3炎症体通路,该通路能否在LPS的刺激下活化并释放炎性介质IL-1β、IL-18目前尚未见明确研究报道。鉴于此,本课题以肺泡上皮来源的A549细胞为实验对象,观察其是否存在NLRP3炎症体通路,并探讨LPS或LPS联合ATP刺激后NLRP3炎症体通路蛋白表达及细胞因子IL-1β、IL-18分泌情况,并明确A549细胞IL-1β、IL-18的分泌是否与NLRP3炎症体有关。目的:探讨肺上皮来源A549细胞在LPS或LPS联合ATP刺激后NLRP3炎症体通路蛋白表达及细胞因子IL-1β、IL-18分泌情况,初步了解NLRP3炎症体通路在人肺上皮来源A549细胞中的作用及机制。研究方法:1.A549细胞内NLRP3/ASC/caspase-1炎症体m RNA及蛋白表达以人肺上皮来源A549细胞作为实验对象,采用RT-PCR、Western blot检测A549细胞是否存在NLRP3/ASC/caspase-1m RNA及蛋白水平表达。2.LPS对A549细胞NLRP3炎症体通路相关m RNA及蛋白表达的影响予以不同浓度LPS(0,1,5,10,50,100μg/ml)刺激A549细胞相同时间及相同浓度LPS(10μg/ml)刺激不同时间(0h,3h,6h,12h,24h,48h),RT-PCR技术检测LPS诱导A549细胞NLRP3、caspase-1m RNA的表达情况,Western blot探讨LPS是否能激活NLRP3炎症体及其激活的最佳时间和浓度。3.LPS联合ATP处理对A549细胞NLRP3炎症体通路蛋白表达的影响根据LPS刺激A549细胞后,NLRP3炎症体通路蛋白表达的时效与量效关系,选定10μg/ml LPS先预激细胞6h,再给以0mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L,2mmol/L,4mmol/L ATP刺激1h,Western blot检测LPS联合ATP刺激是否能激活A549细胞的NLRP3炎症体通路。4.不同刺激条件对A549细胞caspase-1活性及IL-1β、IL-18分泌的影响将实验分为对照组、LPS单独刺激组、ATP单独刺激组、LPS联合ATP刺激组,caspase-1活性检测试剂盒检测caspase-1活性,Western blot、ELISA技术分别检测NLRP3炎症体通路蛋白表达及IL-1β、IL-18分泌情况,。5.NLRP3-si RNA干扰对LPS联合ATP诱导的A549细胞分泌IL-1β、IL-18的影响采用NLRP3-si RNA下调NLRP3基因表达后,ELISA检测LPS联合ATP刺激A549细胞后细胞培养上清中IL-1β、IL-18浓度变化。结果:1.A549细胞中存在NLRP3炎症体各组件NLRP3、ASC、caspase-1m RNA及蛋白水平的表达。2.与对照组相比,LPS单独处理组可诱导A549细胞NLRP3、caspase-1m RNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达升高(P<0.05),且表达量具有LPS时间和剂量依赖性,但是不能诱导活化形式的caspase-1p20蛋白表达及细胞因子IL-1β、IL-18的分泌(P>0.05),3.与对照组相比,ATP单独刺激组不引起NLRP3、caspase-1 p45、caspase-1p20、pro-IL-β蛋白表达变化及IL-1β、IL-18分泌(P>0.05)。4.与LPS单独刺激组相比,LPS联合ATP刺激组检测到活化形式的caspase-1p20蛋白表达及IL-1β、IL-18的分泌(P<0.05)。与对照组、LPS单独刺激组和ATP单独刺激组相比,LPS联合ATP刺激组A549细胞caspase-1活性最强(P<0.05),对照组、LPS单独刺激组和ATP单独刺激组之间caspase-1活性无差异(P>0.05)。5.采用NLRP3-si RNA下调NLRP3基因表达,可抑制LPS联合ATP诱导的A549细胞IL-1β、IL-18的分泌。结论:1.在肺上皮来源A549细胞中存在NLRP3炎症体通路。2.LPS可上调NLRP3炎症体通路NLRP3m RNA、caspase-1m RNA及NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达,但是不能活化NLRP3炎症体,单独的ATP既不能上调NLRP3炎症体通路蛋白表达,也不能活化NLRP3炎症体。3.LPS联合ATP刺激A549细胞可活化NLRP3炎症体,表现为活性形式的caspase-1p20蛋白的表达、活性形式的IL-1β、IL-18分泌、caspase-1活性增强,提示A549细胞中NLRP3炎症体的完全激活可能需要两种不同刺激因素的参与。3.LPS联合ATP诱导A549细胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-18在下调NLRP3基因以后显著减少,初步提示IL-1β、IL-18的分泌可能是受NLRP3炎症体途径调控。综合上述结果,本课题对来源于肺上皮的A549细胞内的NLRP3炎症体通路表达及调控机制进行的初步的观察和研究,为深入研究NLRP3炎症体在ARDS等肺部炎症性疾病的发生、发展过程对肺泡上皮细胞的作用及具体机制奠定了一定的理论基础。