一、研究目的本课题通过理论与实验研究，探讨猪牙皂提取物正丁醇部位、乙醇部位抑制人肝癌细胞SMMC-7721的效果，并从分子水平、蛋白水平研究该药物对PI3K/AKT相关细胞信号通路的影响，阐述猪牙皂抗肝癌的可能机理。二、研究方法第一部分理论研究1.中医防治原发性肝癌具有减少癌变、减轻临床症状、减少术后症状及复发、提高免疫力、提高生存质量和远期疗效的优势。2.中医治疗原发性肝癌可以从痰瘀出发，化痰药猪牙皂具有抗肝癌的研究价值。第二部分实验研究1.根据人临床用量（猪牙皂生药量1.5g.70kg.d-1）、人与大鼠的等效剂量倍数，倍增至7倍为实验低剂量，按1：2：4比例，设为低、中、高剂量组，将40只Wistar雄性大鼠随机分为4组，即：对照（空白血清）组、正丁醇部位低剂量(0.15g.kg.d-1)组、中剂量(0.3g.kg.d-1)组和高剂量(0.6g.kg.d-1)组，每组10只大鼠。连续灌胃三天，心脏采血，同组血清合并。利用噻唑蓝还原法(MTT法)检测猪牙皂提取物正丁醇部位含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制率。2.根据人临床用量（猪牙皂生药量1.5g.70kg.d-1）、人与大鼠的等效剂量倍数，倍增至7倍为实验低剂量，按1：2：4比例，设为低、中、高剂量组，将220只Wistar雄性大鼠随机分为22组，即：对照（空白血清）组1组，乙醇部位含药血清按30%、60%、95%、30%+60%、60%+95%、30%+95%、30%+60%+95%分为7个浓度，每个浓度再分别按低、中、高剂量各设1个实验组，乙醇部位含药血清总共分为21个组，每组10只大鼠。连续灌胃三天，心脏采血，同组的血清合并。利用MTT法检测猪牙皂提取物乙醇部位含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制率。3．实验分为3组:空白组（人肝癌细胞SMMC-7721,未加任何药物），猪牙皂组（将实验二的猪牙皂提取物正丁醇部位中剂量组按10%浓度加入人肝癌细胞SMMC-7721），索拉非尼组（将4μmol/l的索拉非尼加入人肝癌细胞SMMC-7721）。采用蛋白印迹法、实时荧光定量PCR分别检测各组0h、0.5h、3h、8h、25h、48h作用时间点的VEGF、PTEN、PI3K、AKT、mTOR、Caspase9。4.统计学分析4.1猪牙皂提取物正丁醇部位各剂量组对SMMC-721肝癌细胞的抑制率应用SPSS18.0进行分析处理，各组检测数据用均数±标准差(x±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。4.2猪牙皂提取物乙醇部位各浓度、各剂量组对SMMC-721肝癌细胞的抑制率应用SPSS18.0进行分析处理。观察指标采用x士s表示指标平均水平及变异性，析因设计方差分析检验不同浓度乙醇、不同剂量猪牙皂的主效应和交互作用，当两者存在交互作用时，进一步做单独效应分析，固定乙醇浓度在某个水平对猪牙皂不同剂量之间进行比较，同样固定猪牙皂在某个水平对乙醇不同浓度之间进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。4.3所有数据录入计算机建立数据库，应用SAS9.0进行分析处理。观察指标采用x士s表示指标平均水平及变异性，利用重复测量方差分析比较索拉非尼和猪牙皂在同一作用时间对肝癌细胞AKT、Caspase9、mTOR、PI3K、PTEN、VEGF六个基因表达的差异，比较索拉非尼在不同作用时间对肝癌细胞六个基因表达的差异，比较猪牙皂在不同作用时间对肝癌细胞六个基因表达的差异。P<0.05为差异有统计学意义。三、研究结果1.猪牙皂提取物正丁醇部位含药血清低剂量组与对照组比较差异（P<0.05）有统计学意义，与中剂量组比较（P>0.05）无统计学意义。中剂量组与对照组比较（P<0.05）有统计学意义，与高剂量比较（P<0.05）有统计学意义。高剂量与对照组比较（P>0.05）无统计学意义。2.猪牙皂提取物乙醇部位含药血清，60%浓度乙醇低剂量组、30%+60%浓度乙醇高剂量、30%+60%+95%浓度乙醇中剂量分别与空白组比较，无统计学差异（P＞0.05）；其它各浓度组、各剂量组分别与空白组比较均有统计学差异（P＜0.05）。猪牙皂提取物乙醇部位不同浓度之间有统计学差异（P＜0.05），不同剂量之间有统计学差异（P＜0.05），不同浓度与不同剂量之间有统计学差异（P<0.05）。3.对比猪牙皂组和索拉菲尼组在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h对六个基因的影响，结果显示：①P TEN的表达：Western blot检测中将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，PTEN表达无差异（P＞0.05），索拉非尼组中，0.5h/3h/8h/25h与空白组比较PTEN表达增加（P＜0.01），48h比较表达无明显变化（P＞0.05）；猪牙皂组中，0.5h/3h/8h与空白组比较PTEN表达明显增加（P＜0.01），25h与空白组比较PTEN表达明显增加（P＜0.05），48h比较表达无明显变化（P＞0.05）。与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/3h/8h对PTEN的上调表达无明显差异（P＞0.05）。而在25h，猪牙皂对PTEN的上调表达要低于索拉非尼组（P＜0.01）；在48h，两组对PTEN的表达均无改变（P＞0.05）。PCR检测中将两组在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的PTEN扩增倍数进行比较，通过统计学分析，25h、48h比较都有统计学差异（P＜0.05），0h/0.5h/3h/8h均无统计学差异（P＞0.05）；将索拉菲尼组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的PTEN扩增倍数分别与0h比较，除在0h与48h差异无统计学意义（P＞0.05）外，0.5h/3h/8h/25h与0h扩增倍数均有显著性差异（P＜0.01）。猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的PTEN扩增倍数分别与0h比较，均有显著性差异（P＜0.01）。另外，索拉菲尼组中各时间点PTEN扩增倍数进行两两比较，在0.5h与25h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P<0.01）；将猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的PTEN扩增倍数进行两两比较也均有显著性差异（P <0.01）。②Caspase9的表达：western blot检测中空白组中，5个时间点与0h的Caspase9表达无变化（P＞0.05）；将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，Caspase9表达无差异（P＞0.05），索拉非尼组中，3h/8h与空白组比较Caspase9表达显著增加（P＜0.01），0.5h/25h与空白组比较Caspase9表达显著增加（P＜0.05），48h比较表达无明显变化（P＞0.05）；猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h与空白组比较Caspase9表达明显增加（P＜0.01）,48h比较表达无明显变化（P＞0.05）。与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/25h/48h对Caspase9的上调表达无明显差异（P＞0.05）。而在3h/8h，猪牙皂对Caspase9的上调表达要高于索拉非尼组（P＜0.01）。PCR检测中将索拉非尼组、猪牙皂组分别在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的Caspase9扩增倍数进行比较，通过统计学分析，3h、8h比较有显著性差异（P＜0.01），0h/0.5h/25h/48h均无统计学差异（P＞0.05）；将索拉菲尼组和猪牙皂中，0.5h/3h/8h/25h/48h的Caspase9扩增倍数分别与0h比较，两组均有除在0h与48h差异无统计学意义（P＞0.05）外，0.5h/3h/8h/25h与0h扩增倍数均有显著性差异（P＜0.01）。另外，分别将两组内各时间点Caspase9扩增倍数进行两两比较，索拉菲尼组在0.5h与25h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P <0.01）；猪牙皂组在0.5h与25h、3h与8h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P <0.01）。③mTOR的表达：western blot检测中将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，mTOR表达无差异（P＞0.05），索拉非尼组中，0.5h/48h与空白组比较mTOR表达减少（P＜0.05），3h/8h/25h与空白组比较mTOR表达显著减少（P＜0.01）；猪牙皂组中，3h/8h与空白组比较mTOR表达明显减少（P＜0.01），0.5h/25h/48h与空白组比较mTOR表达减少（P＜0.05）。与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/3h/8h/25h对mTOR的下调表达无明显差异（P＞0.05）。而在48h，猪牙皂对mTOR的下调表达要弱于索拉非尼组（P＜0.01）。PCR检测中将索拉非尼组、猪牙皂组分别在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的mTOR扩增倍数进行比较，通过统计学分析，48h比较有显著性差异（P＜0.01），0h/0.5h/3h/8h/25h均无统计学差异（P＞0.05），将索拉菲尼组和猪牙皂，在0.5h/3h/8h/25h/48h的mTOR扩增倍数分别在组内与0h比较，均有显著性差异（P＜0.01）。另外，将各时间点mTOR扩增倍数进行两两比较，两组也均有在0.5h与25h、3h与48h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P <0.01）。④P I3K的表达：western blot检测中空白组中，5个时间点与0h的PI3K表达无变化（P＞0.05）；将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，PI3K表达无差异（P＞0.05），索拉非尼组中，3h/8h与空白组比较PI3K表达显著减少（P＜0.01），0.5h与空白组比较PI3K表达减少（P＜0.05），25h/48h与空白组比较表达无明显变化（P＞0.05）；猪牙皂组中，3h/8h/25h/48h与空白组比较PI3K表达显著减少（P＜0.01），0.5h比较表达无明显变化（P＞0.05）。将猪牙皂组与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/3h/8h对PI3K表达调控较为相似，且在3h/8h对PI3K的下调表达无明显差异（P＞0.05）。而在25h/48h，猪牙皂对PI3K的下调表达要弱于索拉非尼组（P＜0.05）。PCR检测中将索拉非尼组、猪牙皂组分别在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的PI3K扩增倍数进行比较，通过统计学分析，25h、48h比较都有显著性差异（P＜0.01），0h/0.5h/3h/8h均无统计学差异（P＞0.05）；将猪牙皂组和索拉菲尼组，在0.5h/3h/8h/25h/48h的PI3K扩增倍数组内分别与0h比较，两组均有显著性差异（P＜0.01）。另外，将各时间点PI3K扩增倍数进行两两比较，索拉菲尼组中0.5h与25h、3h与8h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P<0.01）；猪牙皂组中，3h与8h比较无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P <0.01）。⑤AKT的表达：western blot检测中将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，AKT表达无差异（P＞0.05），索拉非尼组中，0.5h/3h/8h/25h/48h与空白组比较AKT表达显著减少（P＜0.01）；猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h/48h与空白组比较AKT表达同样明显减少（P＜0.01）。与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h对AKT表达调控均无明显差异（P＞0.05）。PCR检测中将索拉非尼组、猪牙皂组分别在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的AKT扩增倍数进行比较，通过统计学分析均无统计学差异（P＞0.05），索拉菲尼组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的AKT扩增倍数分别与0h比较，除在0h与48h差异无统计学意义（P＞0.05）外，0.5h/3h/8h/25h与0h扩增倍数均有显著性差异（P＜0.01）。而猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的AKT扩增倍数分别与0h比较，均有显著性差异（P＜0.01）。另外，将各时间点AKT扩增倍数进行两两比较，两组都有0.5h与25h、3h与8h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P<0.01）。⑥VEGF的表达：western blot检测中空白组中，5个时间点与0h均VEGF的表达无变化（P＞0.05）；将空白组与索拉菲尼组、空白组与猪牙皂组分别在0h进行比较，VEGF表达无差异（P＞0.05），说明三组在0h的VEGF表达无明显差异，索拉非尼组中，0.5h/3h/8h/25h/48h与0h比较VEGF表达显著减少（P＜0.01）；猪牙皂组中，0.5h/3h/8h/25h/48h与0h比较VEGF表达同样明显减少（P＜0.01）。并且将猪牙皂组与索拉非尼组相比，猪牙皂组在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h对VEGF表达调控均无明显差异（P＞0.05）。 PCR检测中将索拉非尼组、猪牙皂组分别在0h/0.5h/3h/8h/25h/48h的VEGF扩增倍数进行比较，通过统计学分析，两组在6个时间点比较均无统计学差异（P＞0.05），将猪牙皂组和索拉菲尼组中，0.5h/3h/8h/25h/48h的VEGF扩增倍数分别与0h比较，两组均有除在0h与48h差异无统计学意义（P＞0.05）外，0.5h/3h/8h/25h与0h扩增倍数均有显著性差异（P＜0.01）。另外，将各时间点VEGF扩增倍数进行两两比较，索拉菲尼组在3h与8h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有统计学差异（P <0.05），而猪牙皂组0.5h与25h、3h与8h比较均无统计学差异（P>0.05），其它时间点的两两比较均有显著性差异（P <0.01）。四、结论1.猪牙皂提取物正丁醇部位含药血清低剂量组、中剂量组对人肝癌细胞SMMC-7721均具有抑制效果，高剂量组无抑制作用。2.猪牙皂提取物乙醇部位除60%浓度乙醇低剂量组、30%+60%浓度乙醇高剂量、30%+60%+95%浓度乙醇中剂量组外，其它不同浓度组及其高、中、低剂量组均能抑制人肝癌细胞SMMC-7721；各浓度组之间、及其高、中、低剂量组之间也存在差异。3.通过对比空白组、索拉菲尼组和猪牙皂组对肝癌细胞中六个基因的表达影响，我们可以看到：①猪牙皂提取物正丁醇部位与索拉非尼作用于肝癌细胞均出现PTEN基因表达上调，说明皂荚提取物与索拉非尼均能通过调控PTEN基因的上调，从而抑制肿瘤血管生成、抑制肝癌细胞增殖。②猪牙皂提取物正丁醇部位与索拉非尼作用于肝癌细胞均出现Caspase9基因表达上调，说明皂荚提取物与索拉非尼均能通过调控Caspase9基因的上调，从而诱导肝癌细胞的凋亡。③猪牙皂提取物正丁醇部位与索拉非尼作用于肝癌细胞均出现mTOR基因、AKT基因、PI3K基因表达下调，说明皂荚提取物与索拉非尼均能通过调控mTOR基因、AKT基因、PI3K基因的下调，阻断PI3k／Akt／mTOR信号通路，从而抑制肝癌细胞的生长。④猪牙皂提取物正丁醇部位与索拉非尼作用于肝癌细胞均出现VEGF基因表达下调，说明皂荚提取物与索拉非尼均能通过调控VEGF基因的下调，从而抑制肿瘤血管生成。⑤对于6个时间点猪牙皂提取物正丁醇部位和索拉非尼作用于肝癌细胞调控6个基因的表达，两组均在3h和8h时对AKT基因、mTOR基因、PI3K基因、VEGF基因的下调作用最为显著；两组均在8h时对PTEN基因上调作用最为显著；索拉非组在8h对Caspase9基因上调作用最为显著，皂荚提取物在3h、8h对Caspase9基因上调作用均较为显著。⑥皂荚提取物与索拉非尼对肝癌细胞中6个基因的调控较为相似，比较皂荚提取物组与索拉非尼组，除在25h，索拉非尼对PTEN上调要强于猪牙皂；在3h/8h/25h，猪牙皂对Caspase9上调要明显强于索拉非尼；在25h/48h，索拉非尼对mTOR下调要强于猪牙皂；在48h，猪牙皂对PI3K下调要强于索拉非尼。4个基因其余时间段和VEGF、AKT的调控均较为相同。