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目的:神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）是胚胎发育过程中由神经管不完全闭合引起的一组严重的先天性中枢神经系统畸形,以脊柱裂、无脑儿和脑膨出为典型表型,据估计,每年约有30万名婴儿被诊断为神经管畸形。NTDs是由环境和遗传因素协同作用引起的一系列复杂的多基因疾病。然而,目前对NTDs发病机制的分子机制的研究只是冰山一角。细胞自噬是一种具有进化优势的过程,通过自噬体与溶酶体融合以降解不需要的细胞质成分。自噬在胚胎发育过程中的稳态的维持发挥了重要的作用,当细胞自噬功能受损,通过自噬途径清除受损细胞成分的能力受到限制,打破了细胞稳态的平衡,最终导致NTDs的形成。细胞凋亡是生物体去除异常的细胞,维持机体内环境稳态的一种关键的程序性死亡的过程。同样的细胞凋亡在胚胎发育过程中也起到关键调控作用。而神经上皮细胞过度凋亡导致神经皱襞内细胞数量不足,是NTDs形成的主要因素。并且越来越多的证据表明,凋亡水平的增强会导致细胞稳态失衡,最终导致神经管的闭合失败。前期研究中发现微小RNA-200b（microRNA-200b,miR-200b）在糖尿病诱导的NTDs小鼠胚胎呈现高表达,并且高糖处理的小鼠神经干细胞miR-200b表达上调并且出现明显凋亡。但关于NTDs诱导miR-200b上调的分子机制仍不清楚本研究旨在探讨miR-200b上游转录因子核因子I-C（NFIC）及其对下游靶标分子的调控机制,通过对细胞自噬及凋亡稳态的影响,参与NTDs发生发展的分子机制。研究方法:1.利用qRT-PCR验证miR-200b、NFIC和NFIB在ARTA诱导的NTDs胎鼠模型中的表达情况。利用生物信息学TransmiR v2.0、JASPAR和h TFtarget预测miR-200b的转录因子。通过qRT-PCR,Western blot检验NFIC和NFIB在NTDs模型中的表达情况。2.分别在小鼠神经干细胞C17.2过表达和沉默NFIC,利用Western blot和q RT-PCR分析NFIC对miR-200b表达水平的调控。利用双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验证明NFIC对miR-200b转录活性的调节。3.生物信息学预测miR-200b的靶基因Ambra1。通过Western blot验证Ambra1在NTDs胎鼠模型中的表达情况。双荧光素酶报告基因实验证明miR-200b与Ambra1的结合作用。通过Western blot和qRT-PCR在C17.2内明确miR-200b对靶基因Ambra1的调控。4.利用Western blot验证NTDs胎鼠模型中LC3自噬水平的变化,通过Western blot和免疫荧光染色确定NFIC/miR-200b/Ambra1通路对小鼠神经干细胞自噬的影响。5.利用Western blot验证NTDs胎鼠模型中凋亡水平的变化,Green NucTM活细胞Caspase-3活性染色以及Tunel实验检测NFIC/miR-200b/Ambra1通路对小鼠神经干细胞凋亡的影响。6.统计分析采用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计分析和图表生成,数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。两组之间的统计比较使用独立样本的t检验,而三组以上数据之间的统计比较使用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05被认为具有统计学意义。结果:1.miR-200b和NFIC在ARTA诱导的NTDs胎鼠模型中表达增加在ARTA诱导的NTDs小鼠中miR-200b表达上调。生物信息学TransmiR v2.0、JASPAR和h TFtarget预测NFIC是miR-200b的潜在转录因子。通过Western blot,qRT-PCR证明NFIC在NTDs小鼠胚胎中蛋白和RNA表达均上调。2.NFIC转录激活小鼠神经干细胞miR-200b的表达2.1当过表达NFIC时,miR-200b表达上调,而当沉默NFIC表达时,miR-200表达相应的下调。2.2过表达NFIC后,miR-200b启动子区域荧光素酶活性显著升高。在miR-200b的启动子中,有三个保守NFIC结合的TTGGCA基序（S1、S2和S3）。内源性的Ch IP实验证明NFIC与miR-200b的三个预测位点结合。并且miR-200b启动子驱动的荧光素酶报告基因在转染NFIC的小鼠神经干细胞中产生了更高水平的荧光素酶活性。3.miR-200b与Ambra1 m RNA相互作用,抑制Ambra1的表达3.1生物信息学预测Ambra1是miR-200b潜在的靶基因。Ambra1在NTDs胎鼠模型中表达下调。3.2双荧光素酶报告基因实验证实miR-200b与Ambra1m RNA的3’UTR端非翻译区结合。且过表达miR-200b后,Ambra1的蛋白表达水平下调;相反的,沉默miR-200b后Ambra1的蛋白表达水平上调。而无论过表达或沉默miR-200b,Ambra1的m RNA水平均不发生改变。4.NFIC/miR-200b/Ambra1通路对小鼠神经干细胞自噬的影响4.1 LC3反应的自噬水平NTDs胎鼠模型中表达下调。4.2过表达NFIC后,抑制了Ambra1的表达,同时LC3的蛋白水平下调;而沉默了NFIC,促进Ambra1的表达,并且增强了LC3的蛋白水平。4.3沉默NFIC后LC3和Ambra1蛋白表达的上升,在此基础上过表达miR-200b则抑制LC3和Ambra1的表达。5.NFIC/miR-200b/Ambra1通路对小鼠神经干细胞凋亡的影响5.1在NTDs胎鼠模型中,促凋亡蛋白Cleaved-caspase3和BAX表达上调,而抑凋亡蛋白Bcl2表达下调。5.2沉默了NFIC后,促凋亡蛋白Cleaved-caspase3和BAX表达下调,抑凋亡蛋白Bcl2表达上调,抑制了细胞的凋亡。5.3过表达NFIC后促进了细胞的凋亡,促凋亡蛋白Cleaved-caspase3和BAX表达上调,而抑凋亡蛋白Bcl2表达下调,同时沉默miR-200b,可以挽救NFIC过表达所诱导的凋亡相关蛋白的改变,同时减少细胞凋亡。结论:1.NFIC是miR-200b的转录因子,通过与miR-200b的启动子相结合,促进miR-200b的表达。2.Ambra1作为miR-200b的新靶点,其翻译能够被miR-200b抑制。3.NFIC通过miR-200b/Ambra1抑制小鼠神经干细胞自噬水平而增加凋亡水平,破坏了神经细胞自噬与凋亡的稳态,从而诱导NTDs的发生。