【摘 要】
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目的:从抗猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）杂交瘤细胞克隆抗体轻重链全长基因,并实现其在真核细胞中的表达。为建立体外生产抗PEDV单克隆抗体平台奠定基础。方法:利用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,采用间接ELISA法检测抗PEDV单克隆抗体的效价与特异性。通过对杂交瘤细胞的染色体数目分析以及间接ELISA法测定其抗体分泌能力的变化,评
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目的:从抗猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）杂交瘤细胞克隆抗体轻重链全长基因,并实现其在真核细胞中的表达。为建立体外生产抗PEDV单克隆抗体平台奠定基础。方法:利用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,采用间接ELISA法检测抗PEDV单克隆抗体的效价与特异性。通过对杂交瘤细胞的染色体数目分析以及间接ELISA法测定其抗体分泌能力的变化,评估杂交瘤细胞株的稳定性。通过RT-PCR从杂交瘤细胞株获取抗体轻重链全长基因,通过酶切连接构建轻重链表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。将轻重链表达质粒共转染CHO-K1细胞,RT-PCR鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的转录,Western Blot鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的表达。利用间接ELISA法和Western Blot检测基因工程抗体的结合活性。分别用人血清白蛋白信号肽、人kappa轻链信号肽,小鼠kappa轻链信号肽、高斯荧光素酶信号肽替代轻链亲本信号肽,对轻链信号肽进行优化。结果:抗PEDV单克隆抗体重链亚型为IgG2a亚型,轻链亚型为Kappa亚型,抗体效价为1:8000左右,抗体特异性较好,与猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、经典猪瘟病毒（Classic swine fever virus,CSFV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV）、猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）均没有交叉反应。杂交瘤细胞连续传代3个月,染色体数目恒定为96条,间接ELISA结果说明杂交瘤细胞在传代过程中分泌抗体的能力无明显变化。琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示,成功构建真核表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。RT-PCR结果说明抗体轻重链基因在CHO-K1细胞中均得到了转录,Western Blot结果说明抗体基因在CHO-K1细胞中成功表达。ELISA和Western Blot结果表明PEDV基因工程抗体具有良好的生物学结合活性。对抗体轻链信号肽进行优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。结论:抗PEDV单克隆抗体的特异性以及亲和力较好。成功克隆到了抗体基因,并实现其在CHO-K1细胞中的瞬时表达。对轻链信号肽进行了优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。
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