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克罗托啡（Crotalphine,CRP）,是从南美洲响尾蛇蛇毒（crotalus durissus terrificus,Cdt）中分离的一种多肽（<EFSPENCQGESQPC,<E是焦谷氨酸,分子内一对二硫键）,具有镇痛活性。关于克罗托啡的作用靶点的最新研究表明,克罗托啡通过作用于TRPA1通道,激活相关的神经通路发挥镇痛作用。文献报道对克罗托啡的研究主要是围绕探究其作用靶点展开,有关克罗托啡结构与生物功能的研究尚未系统展开。本论文以克罗托啡为研究对象,开展其结构-活性关系研究,为研发新型镇痛药奠定理论依据和技术支撑。一、通过定点突变探究克罗托啡结构与镇痛活性的关系。采用丙氨酸扫描策略,将克罗托啡中的非丙氨酸序列逐一替换成为丙氨酸,合成13个丙氨酸扫描突变体,分别为CRP-F2A、CRP-S3A、CRP-P4A、CRP-E5A、CRP-N6A、CRP-C7A、CRP-Q8A、CRP-G9A、CRP-E10A、CRP-S11A、CRP-Q12A、CRP-P13A和CRP-C14A。为了探究二硫键和C端酰胺化对克罗托啡的镇痛活性的影响,设计合成了4个突变体:二硫键打开的突变体CRP-15;C端酰胺化,二硫键打开的突变体CRP-16和C端酰胺化突变体CRP-17;7位的半胱氨酸突变成丝氨酸的CRP-C7S。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）分别确定合成克罗托啡及其突变体的纯度及序列的准确性,通过圆二色谱（CD）分析氨基酸点突变或二硫键打开及C端酰胺化修饰对克罗托啡二级结构的影响。通过醋酸扭体实验、炎性痛模型对克罗托啡及其突变体的镇痛活性进行评价。结果表明,经固相法合成的克罗托啡及其突变体的色谱纯度均在95%以上;通过丙氨酸扫描策略和对二硫键进行改造产生的突变体二级结构是以无规则卷曲为主;在小鼠醋酸扭体模型上,与生理盐水相比,除突变体CRP-C14A、CRP-15和CRP-17外,其他突变体均有显著镇痛活性（p<0.05）。与CRP相比,突变体CRP-E5A的镇痛活性增强约20%（p<0.05）。突变体CRP-Q8A和CRP-C14A镇痛活性分别下降14%和35%（p<0.05）。CRP-15和CRP-17的镇痛活性显著下降（p<0.05）。在两个炎性疼痛模型中,测得克罗托啡镇痛效能的ED50值分别为3.66μg/kg和6.28μg/kg。与生理盐水组比,CRP-E5A、CRP-Q8A均有显著镇痛活性（p<0.05）.与克罗托啡相比,CRP-15和CRP-17的镇痛活性显著下降。与克罗托啡相比,CRP-C14A的镇痛活性显著下降（p<0.05）。这些结果表明克罗托非的第5、8、14的氨基酸是其发挥镇痛活性重要氨基酸。二、依据标准方法研究CRP在模拟胃肠液中的稳定性。参照中国药典,建立克罗托啡的色谱（RP-HPLC）分析方法,对模拟胃肠液中的CRP及其突变体CRP-E5A进行定性和定量分析。研究结果表明:克罗托啡在模拟胃液（SGF）中消化相对稳定,消化12h,降解18%。在模拟肠液（SIF）中,消化12h,含量减少约64%。突变体CRP-E5A在SGF中消化4h后,大约降解20%,在SIF中大概降解40%。消化12h后,含量减少约为37%,在SIF中,消化12h后,含量减少约为80%。本论文采用丙氨酸扫描策略对克罗托啡中所有氨基酸进行丙氨酸突变并进行镇痛活性评价,研究表明克罗托啡第5、8、14的氨基酸是其发挥镇痛活性重要氨基酸,突变体CRP-E5A镇痛活性明显增强,可望发展为镇痛药先导物。针对CRP及其突变体能口服原因,开展了对CRP及其突变体CRP-E5A消化稳定性研究,结果显示CRP耐酸且在人工胃肠液中稳定,突变体CRP-E5A在人工胃肠液稳定,但消化速度相较于CRP有所增加。这些研究结果为后续克罗托啡结构改造以及新型镇痛药研发奠定了基础。
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