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研究背景:我国是原发性肝癌(primary hepatocarcinoma,PHC)的高发区。原发性肝癌在我国恶性肿瘤的发病率中占第三位,死亡率为我国男性恶性肿瘤的第二位,女性恶性肿瘤的第四位。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在我国占PHC的绝大多数(91.5%),但其具体发病机制尚未阐明,目前有各种假说得以提出,其中肿瘤细胞的增殖和凋亡倍受关注。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)属于转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)超家族,是一种在细胞生长、分化、凋亡和机体多种组织和器官形态发生中起重要调控的细胞因子。研究已经证实,BMP-2有促进细胞分化和凋亡、抑制细胞增殖的作用。本研究期望了解BMP-2在肝细胞性肝癌发生发展中的作用、BMP-2对肝细胞癌细胞增殖和凋亡的影响、BMP-2在肝细胞癌中是否通过其受体BMPR(bone morphogenetic protein receptor,BMPR)发挥作用、BMP-2在肝细胞癌中传递信号的受体后信号传导通路是什么?为今后深入研究BMP-2对肝细胞癌的作用提供理论基础,也为肝癌的防治提供新的资料和线索。首先,第一章我们研究了BMP-2及其受体在肝癌HepG-2细胞中的表达以及对其增殖和凋亡的影响。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来出现的一种高效地封闭特异性基因的新技术,近年来在功能基因组还是肿瘤的基因研究方面都得到广泛的应用。第二章我们采用小分子干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)干扰抑制HepG2细胞BMP-Ⅱ受体(bone morphogenetic protein receptor-Ⅱ,BMPR-Ⅱ)的表达,然后观察BMP-2是否通过BMPR-Ⅱ影响HepG2细胞的增殖和凋亡。目前还没有BMP-2/BMPR在肝细胞癌中受体后通路的研究报道,为了解BMP-2/BMPR在肝细胞癌中受体后传导通路,我们在第三章研究了BMP-2对人肝癌HepG-2细胞增殖和凋亡的受体后信号传导通路。第一章骨形成蛋白-2对人肝癌HepG-2细胞株增殖和凋亡的作用目的:观察骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2;BMP-2)对人肝癌HepG-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:(1)Western blot检测BMP-2蛋白及其IA、IB、Ⅱ型受体的表达。(2)MTT法检测细胞存活率。(3)~3H-TdR掺入法检测细胞增殖。(4)台盼蓝拒染法检测细胞生长曲线。(5)ELISA,流式细胞仪分析检测细胞凋亡。结果:(1)Western blot表明BMP-2及其IA、IB、Ⅱ型BMP受体在正常肝细胞和肝癌HepG-2细胞中均有表达。BMP-2蛋白在HepG-2细胞中的表达与在正常肝细胞中的表达相比显著降低,P＜0.01。IA、IB、Ⅱ型BMP受体在正常肝细胞和肝癌HepG-2细胞中表达无差异,P＞0.05。(2)MTT检测细胞活力结果显示10、100ng/mlBMP-2干预组与对照组相比HepG2细胞活力显著降低,P＜0.05。(3)[~3H]TdR掺入法测细胞增殖结果显示,1、10ng/mlBMP-2干预后与对照组相比HepG2细胞增殖量显著下降,P＜0.05;100ng/mlBMP-2干预后HepG2细胞增殖量进一步显著下降,P＜0.01。(4)台盼蓝拒染法测细胞生长曲线结果显示,100ng/mlBMP-2干预后HepG2细胞数显著减少,随着时间的延长,作用越明显,与对照组比P＜0.05。(5)流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,100ng/ml BMP-2干预组与对照组相比HepG2细胞凋亡显著增加,P＜0.05。(6)ELISA检测细胞凋亡结果显示,不同浓度BMP-2干预HepG2细胞24h后,1ng/ml干预组与对照组相比HepG2细胞凋亡显著增加,P＜0.05,10、100、200 ng/ml干预组与对照组比HepG2细胞凋亡进一步显著增加,P＜0.01;在不同时间内100ng/ml BMP-2干预HepG2细胞,6小时干预组与对照组相比,HepG2细胞凋亡显著增加,P＜0.05;12、24、48小时干预组与对照组相比,HepG2细胞凋亡进一步显著增加,P＜0.01。结论:(1)肝癌HepG-2细胞中BMP-2表达量显著低于正常肝细胞,受体BMPR-IA、BMPR-IB及BMPR-II蛋白的表达与正常肝细胞相比无差异。我们推测肝癌细胞BMP-2表达量的降低可能与肝癌的发生发展有关,BMP-2可能通过其受体在肝细胞癌和正常肝细胞中发挥作用。(2)BMP-2对肝癌HepG-2细胞具有抑制增殖、促进凋亡作用,并且呈时间和剂量依赖关系,时间越长,剂量越大,其作用越明显。我们推测BMP-2可能通过促进细胞凋亡、抑制细胞增殖来调控肝细胞癌的发生发展。第二章RNA干扰抑制骨形成蛋白受体表达研究及其在BMP-2影响HepG-2细胞株增殖和凋亡中的作用目的:采用RNA干扰技术抑制HepG2细胞BMPR-Ⅱ表达,旨在观察BMP-2是否通过BMPR影响HepG2细胞的增殖和凋亡。方法:(1)用小分子干扰RNA(Small interfering RNAs;siRNAs)干扰抑制BMPR-Ⅱ表达。(2)用Western blot检测干扰组和对照组HepG-2细胞BMPR-Ⅱ的表达。(3)用[~3H]TdR掺入法检测干扰组和对照组HepG-2细胞增殖。(4)用ELISA法检测干扰组和对照组HepG-2细胞凋亡。结果:(1)Western blot检测显示BMPR-Ⅱ-siRNA转染HepG2细胞后无BMPR-Ⅱ蛋白表达。(2)用[~3H]TdR掺入法检测HepG-2细胞增殖显示BMP(+)control-siRNA与BMP(-)control-siRNA相比,细胞增殖显著下降,P＜0.01;BMP(+)BMPR-Ⅱ-siRNA组与BMP(+)control-siRNA组比细胞增殖显著增加,P＜0.01。(3)ELISA法检测HepG-2细胞凋亡显示BMP(+)control-siRNA组和BMP(-)control-siRNA组相比,细胞凋亡显著增加,P＜0.01;BMP(+)BMPR-Ⅱ-siRNA组与BMP(+)control-siRNA组比细胞凋亡显著下降,P＜0.01。结论:BMPR-Ⅱ-siRNA转染HepG2细胞后可沉默细胞中BMPR-Ⅱ蛋白的表达;BMPR-Ⅱ-siRNA转染HepG-2细胞后可抑制BMP-2对HepG-2细胞增殖和凋亡的作用,证实BMP-2通过其受体BMPR抑制HepG-2细胞增殖并促进其凋亡。第三章骨形成蛋白-2对人肝癌HepG-2细胞株增殖和凋亡的受体后信号通路研究目的:观察骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2;BMP-2)影响人肝癌HepG-2细胞增殖和凋亡的受体后信号通路。方法:(1)Western blot检测BMP-2对HepG2细胞中JNK,p38,ERK,Akt蛋白激酶磷酸化的影响。(2)采用western blot检测BMP-2联合JNK信号传导阻断剂sp600125或者BMP-2联合BMPR-Ⅱ-siRNA转染干扰对JNK磷酸化的影响。(3)BMP-2联合MAPK信号转导阻断剂SP600125、SB203580、PD98059、PI-3激酶信号转导阻断剂LY294002进行干预,[~3H]TdR掺入法检测细胞增殖,ELISA法检测细胞凋亡。结果:(1)BMP-2可诱导HepG-2细胞p-JNK表达并随作用时间的增加,其表达越明显,BMP-2联合BMPR-Ⅱ-siRNA转染可阻断此效应。(2)JNK阻断剂SP600125可阻断BMP-2对HepG-2细胞增殖和凋亡的作用,而ERK阻断剂PD98059、p38阻断剂SB203580和PI-3激酶阻断剂LY294002对BMP-2的作用无影响。结论:(1)BMP-2促进JNK磷酸化且呈时间依赖性,其作用能被JNK信号传导抑制剂或者siRNA-BMPR-Ⅱ抑制,表明BMP-2通过其细胞上的受体BMPR-Ⅱ诱导JNK磷酸化。(2)BMP-2通过BMPR/JNK信号转导途径介导对HepG2细胞增殖和凋亡的调控,与PI-3 K/Akt通路及其他MAPK通路包括ERK MAPK、p38 MAP通路无关。