过氧化氢酶(Hydrogen peroxidase),又称触酶(Catalase,简称CAT),是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是以过氧化氢为底物,通过催化一对电子的转移而将其分解为水和氧气。在植物中CAT清除光呼吸、线粒体电子传递及脂肪酸β-氧化等过程中产生的H2O2。大量研究表明,CAT在植物防御、胁迫应答、延缓衰老及控制细胞的氧化还原平衡等方面起重要作用。成功构建了葡萄过氧化氢酶(VvCAT)的表达质粒,在毕赤酵母中表达并得到纯化的过氧化氢酶,从而进一步研究过氧化氢酶的酶学特性,可以为该酶在植物新陈代谢的生理功能提供了研究基础。本研究通过重叠延伸PCR技术消除VvCAT基因内部的BamH|切点,根据毕赤酵母密码子的偏好性进行改造。为了进一步研究VvCAT蛋白的酶学特性,通过电击转化法将带有目的基因的重组质粒表达载体转化毕赤酵母,添加了AOX1启动子使其在毕赤酵母中进行甲醇诱导分泌表达。对表达的葡萄过氧化氢酶使用6×His与镍柱结合的方法进行纯化与蛋白定量,通过对其进行SDS-PAGE电泳,得到葡萄过氧化氢酶的分子量为55KD左右。对VvCAT进行酶学性质分析,得到其对于底物H2O2的最适反应温度与pH值分别为40℃和9.0,在30℃是温度稳定性最高,对碱性范围内的缓冲环境具有良好的稳定性,对金属离子Mn2+高度敏感产生抑制作用,K+、A13+可以提高酶的活性。葡萄的过氧化氢酶对于底物过氧化氢的酶反应动力学常数Km值为4.806mmol/L,Vmax为102.04μmol mg-1min-1。叠氮化钠、盐酸羟胺以及抗坏血酸对于酶的活性有强烈的抑制作用,并且单功能过氧化氢酶的专一抑制剂3-氨基-1,2,4三唑也会抑制酶活。以愈创木酚检测酶的过氧化物酶活性,没有出现明显的颜色反应。由此可知该酶为单一功能过氧化酶。