研究背景和目的核转录因子-κB (NF-κB)自被发现以来便成为人们研究真核生物转录因子的热点。很多研究显示NF-κB信号转导通路的激活可以调节细胞中很多种基因的表达,其中受调控的基因涉及到细胞和机体的重要过程,包括细胞凋亡、细胞应激反应、细胞增殖、固有免疫、胸腺发育、胚胎发生、炎症反应、病毒感染等多种病理生理过程。正常情况下,NF-κB的转录活性处于动态平衡中。NF-κB信号通路失调,可以导致很多人类和动物的疾病,尤其是慢性炎症、免疫缺陷性疾病和肿瘤。研究发现NF-κB是与癌症相关的非常重要的转录因子,在很多实体瘤和血液系统肿瘤中,NF-κB处于持续的高度激活状态,例如霍奇金氏淋巴瘤(HL)、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞型白血病(ALL)等。而且许多病毒的蛋白成分可以激活NF-κB信号通路,最终导致肿瘤形成。例如,Tax和LMP1分别是HTLV-1和EBV的主要蛋白成分,二者可激活NF-κB信号通路,最终导致肿瘤形成。另外由EBV感染所引起的弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)细胞中, NF-κB信号通路也是处于高度激活的状态。研究表明通过抑制持续性激活的NF-κB可以阻碍致瘤细胞潜在的致瘤性,可以抑制肿瘤细胞的生长,促进瘤细胞凋亡。钙调磷酸酶调节蛋白1基因(the regulator of calcineurin 1 gene, RCAN1)亦称作唐氏综合症关键区域1基因(Down Syndrome Critical Region 1 gene,DSCR1),是在老年痴呆症(AD)和唐氏综合症(DS)的发病机制中起重要作用的基因。研究发现RCAN1参与了对钙调磷酸酶的双重调控作用,即一方面RCAN1可以通过抑制钙调磷酸酶calcineurin的活性抑制calcineurin-NFAT信号转导通路,另一方面RCAN1能被calcineurin-NFAT信号转导通路激活。RCAN1可以与NIK相结合,并且NF-κB可以促进RCAN1.4的转录,即RCAN1对细胞内核转录因子-κB信号通路有一定的调控作用。这些都说明了RCAN1在细胞分化、凋亡、记忆等生物学过程中有重要的功能。最近的一些研究表明,RCAN1基因的表达失调可以导致许多疾病的发生和发展,尤其在AD和DS的发病机制中起到重要作用。但值得注意的是,RCAN1可以抑制肿瘤的生长,即上调RCAN1的表达可以通过抑制血管内皮calcineurin信号途径起到广泛的抗肿瘤作用。其主要的机制是RCAN1能够抑制calcineurin-NFAT信号途径,从而抑制肿瘤血管内皮细胞的生成,从而有效地抑制肿瘤的生长。于此结果一致的是,调查发现在唐氏综合症患者人群中,许多癌症的发病率明显下降,如白血病、实体瘤的发病率明显低于普通人群。目前所有的研究表明,RCAN1对肿瘤的抑制作用主要是通过抑制calcineurin-NFAT信号途径,抑制肿瘤血管内皮细胞的生成,从而抑制肿瘤的生长。而对RCAN1抑制肿瘤的新的机制研究较少,其中RCAN1对NF-κB的作用及对淋巴瘤的作用机制有待深入研究。之前我们的研究发现,NF-κB可以激活RCAN1.4的基因启动子,促进RCAN1.4蛋白质的表达。而RCAN1过表达是否对NF-κB有一定的作用却不是很明确。RCAN1在细胞的分化和凋亡中起到非常重要的作用,并且能够抑制肿瘤血管的生成,而NF-κB在肿瘤细胞的生长中是非常重要的转录因子,所以本课题拟研究钙调磷酸酶调节因子1对NF-κB作用的分子机制,及RCAN1对淋巴瘤生长的影响,并在此基础上对RCAN1的临床应用进行探讨。材料和方法1.细胞培养：共培养了HEK293、Raji、CA46、Daudi、Farage五种细胞,用作后续实验。2. RCAN1对NF-κB转录活性的调节：将RCAN1主要亚型RCAN1.1、RCAN1.4的表达质粒pRCAN1.1-6myC、pRCAN1.4-6myc和RCAN1的干扰质粒si-RCAN1及其对照质粒分别同pNF-KBLuc/pRLTK共同转染到HEK293细胞内。细胞转染48小时后,收取细胞,通过双荧光素酶基因报告系统,检测NF-κB启动子的活性。将质粒pRCAN1.1 mychis、pRCAN1.4mychis、si-RCAN1及其对照质粒分别与NF-κB的表达质粒pNF-κB共同转染到HEK293细胞中,转染48小时后,分别提取细胞的核蛋白和胞质蛋白,通过Western Blotting技术分别检测细胞核和胞质中NF-κB的蛋白质水平。TBP和β-actin分别作为核蛋白和胞质蛋白的内参对照。将质粒si-RCAN1及其对照质粒si-con分别同质粒pRCAN1.1-6myc共转染到HEK293细胞中,转染48小时后,裂解细胞,提取细胞总蛋白,应用Western Blotting技术检测细胞总蛋白中RCAN1的蛋白质水平,即检测质粒si-RCAN1的干扰效率。β-actin作为细胞总蛋白的内参对照。3. RCAN1影响核转录因子抑制子IκBα蛋白水平分子机制的研究：将RCAN1的表达质粒pRCAN1.1-6myc、 pRCAN1.4-6myc,干扰质粒si-RCAN1及其对照质粒分别转染到HEK293细胞中,转染后48小时,提取细胞总蛋白,并通过Western Blotting技术、用anti-IκBα抗体检测内源性IκBα在细胞总蛋白中的表达水平。用anti-myc (9E10)抗体检测质粒pRCAN1.1-6myc、 pRCAN1.4-6myc在细胞内的表达情况。β-actin作为细胞总蛋白的内参对照。将质粒si-RCAN1和pNF-KBluc/pRLTK共同转染到HEK293细胞中,然后分别加入IKK的抑制剂Bay11-7085和酪氨酸激酶的抑制剂Genistein,48小时后检测NF-κB的萤光素酶活性。将质粒pRCAN1.1mychis和si-RCAN1及其对照质粒分别转染到HEK293细胞中,48小时后,加入终浓度为200mM双氧水刺激细胞,分别在Omin、10min、20min、 30min、60min收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western Blotting检测内源性IκBα的变化情况。β-actin作为细胞总蛋白的内参对照。将野生型IκBα的表达质粒IκBα-myc以及IκBα的突变质粒IκBα-Y42E-myc、IκBα-Y42F-myc分别同pRCAN1.1mychis共同转染到HEK293细胞中,48小时后,加入终浓度为200mM双氧水刺激,分别在Omin、10min、20min收集细胞,提取细胞总蛋白,应用WesternBlotting检测外源性IκBα的蛋白质表达水平。β-actin作为细胞总蛋白的内参对照。将干扰质粒si-RCAN1和si-con分别转染到HEK293细胞中,用anti-IκBα-phospho-Y42抗体做免疫沉淀,用anti-IκBα抗体做WesternBlotting，检测干扰RCAN1的表达对IκBα的42位酪氨酸磷酸化的影响。将质粒pRCAN1.1-6myc、 pRCAN1.4-6myc别转染到HEK293细胞中,用anti-IκBα-phospho-Y42抗体做免疫沉淀,用anti-IκBα抗体做WesternBlotting,检测过表达RCAN1对IκBα的42位酪氨酸磷酸化的影响。4. RCAN1对淋巴瘤细胞系Raji、CA46、Daudi、Farage的细胞活性的检测：包装RCAN1的腺病毒表达载体Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4和对照病毒Ad-GFP。通过氯化铯密度梯度离心的方法分离纯化重组腺病毒。应用终极稀释法检测纯化的腺病毒的滴度。用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4分别以MOI为30感染淋巴瘤细胞系Raji。48小时后,荧光显微镜下观察细胞,并收集细胞,WesternBlotting检测RCAN1在淋巴瘤细胞系Raji中的表达情况,并检测内源性IκBα的蛋白表达水平。同样用重组腺病毒感染Raji细胞过表达RCAN1后,4天以后用caspase3/7检测试剂盒,检测细胞内caspase3/7的水平。用腺病毒Ad-GFP、 Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4感染Raji细胞,用CCK8或者MTT法检测RCAN1对Raji细胞活性的影响,选用10nM NF-κB activation inhibitor药物培养的Raji细胞作为实验的阳性对照。用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4以MOI为60感染淋巴瘤细胞系CA46、 Daudi、Farage,72小时后,荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光,感染4-5天后收集细胞,WesternBlotting检测淋巴瘤细胞系CA46、Daudi、Farage中内源性IκBα的蛋白质的表达情况。5.检测RCAN1在SCID鼠移植性淋巴瘤生长中的作用：用重组腺病毒Ad-GFP、 Ad-RCAN1.1感染淋巴瘤细胞系Raji,培养48小时后,用台盼蓝染细胞,并在显微镜下观察细胞活力,进行活细胞计数。根据活细胞计数结果用lxPBS将活细胞浓度调整至1×106～1×107/ml,然后进行SCID小鼠腹背部皮下注射,每只注射200ul。在进行皮下注射前,将SCID小鼠随机分为2组,每组10只。小鼠成瘤后,观察每组小鼠成瘤率,每日观察并记录每只小鼠肿瘤直径、体重,最后对数据进行统计分析。两周后取瘤,提取瘤组织总蛋白,WesternBlotting检测瘤组织中IκBα的蛋白质水平。6.RCAN1与IκBα蛋白-蛋白相互作用及RCAN1功能区域的研究：将质粒pRCAN1.1-6myc转染到HEK293细胞中,48小时后收集细胞,用anti-myc(9E10)抗体做免疫沉淀,用anti-IκBα抗体做WesternBlotting检测；相反的用anti-IκBα抗体作免疫沉淀的抗体,用anti-myc(9E10)抗体做WesternBlot检测,以确定RCAN1与内源性IκBα的相互作用。用IgG抗体做阴性对照。收集未转染的HEK293细胞,用DCT3抗体(RCAN1-N-末端抗体)作免疫沉淀的抗体,用anti-IκBα抗体做WesternBlotting检测,确定内源性的RCAN1与内源性IκBα之间存在蛋白蛋白相互作用。用IgG抗体做阴性对照。为了确定RCAN1与IκBα相互作用的功能区域,我们构建了RCAN1不同截短片段的表达质粒,pRCAN1-1-103、pRCAN1-51-103、pRCAN1-51-172、 pRCAN1-141-172、pRCAN1-141-197。分别表达RCAN1的1-103aa、51-103aa、 51-172aa、141-172aa、141-197aa。将野生型RCAN1的表达质粒pRCAN1.1-6myc和以上RCAN1截短突变的表达质粒分别转染HEK293细胞,48小时后,用anti-my-(9E10)作为免疫沉淀的抗体,用anti-IκBα做WesternBlot检测,确定RCAN1与IκBα相互作用的功能区域。7.检测RCAN1-1-103aa对NF-κB的作用及RCAN1对NF-κB的影响是否通过calcineurin起作用：将质粒pRCAN1-1-103和质粒pRCAN1.1-6myc分别同pNF-κBluc/pRLTK共转染到HEK293细胞中,转染48小时后,通过双荧光素酶基因报告系统检测NF-κB的启动子活性。包装RCAN1-1-103勺腺病毒表达载体,用腺病毒Ad-RCAN1-1-103感染Raji细胞,4天以后用CCK8检测细胞活性,用Ad-GFP做腺病毒载体的对照。将质粒pRCAN1-1-103. pRCAN 1.1-6myc.si-RCAN1、calcineurin的表达质粒分别同pNFATLuc/pRLTK共转染到HEK283细胞中,细胞转染48小时后,通过双荧光素酶基因报告系统检测NFAT启动子的活性。将质粒pRCAN 1.1-6myc、si-RCAN1、calcineurin的表达质粒分别同pNF-κBluc/pRLTK共同转染到HEK283细胞中,细胞转染48小时后,通过双荧光素酶基因报告系统检测NF-κB启动子的活性。8. RCAN1及RCAN1-1-103蛋白质的分离纯化及蛋白活性的检测：为进一步研究RCAN1在抑制肿瘤方面的分子机制和临床应用,我们构建了含有RCAN1.1基因的原核生物表达载体pet28b-RCAN1.1、pet28b-RCAN1-1-103、 pet28b-TAT-RCAN1.1、 pet28b-TAT-RCAN1-1-103.将这些表达载体分别转化到BL21(DE3)感受态细胞中,挑取阳性单菌落培养,并扩增细菌至2ml菌液量。加入0.5mM的IPTG诱导表达,WesternBlot中用anti-His抗体验证诱导蛋白的表达情况,之后大量扩增细菌至1L菌液量。然后收集细菌,超声裂解细菌细胞,离心后将上清通过Ni-NTA Resin亲和层析柱,收集目的蛋白。检测蛋白浓度,并通过WesternBlot验证纯化的蛋白。用纯化的蛋白处理HEK293细胞,通过细胞免疫荧光染色验证纯化蛋白的活性。实验结果1. RCAN1抑制NF-κB的转录活性：将质粒pRCAN1.1-6myc、pRCAN1.4-6myc、质粒si-RCAN1及其对照质粒分别同pNF-κBLuc/pRL-TK共同转染到HEK293细胞内,48小时后,双荧光素酶活性检测发现,与对照相比,细胞内高表达RCAN1.1、RCAN1.4可明显抑制NF-κB的启动子活性；干扰RCAN1的表达却可明显增加NF-κB的启动子活性。将质粒pRCAN1.1mychis、 pRCAN1.4mychis及其对照质粒分别与质粒pNF-κB共转染到细胞HEK293中,转染48小时后,提取细胞核蛋白和胞质蛋白,应用WesternBlot技术检测发现,在细胞内高表达RCAN1可以抑制NF-κB进入细胞核发挥作用,相应的,NF-κB在胞质中的含量升高。将质粒si-RCAN1及其对照质粒si-con分别与质粒pNF-κB共同转染到细胞HEK293中,转染48小时后,提取细胞核蛋白,应用WesternBlot检测发现干扰RCAN1的表达可以明显的提高NF-κB进入细胞核的水平。将质粒si-RCAN1及si-con分别同质粒pRCAN1.1-6myc共转染到HEK293细胞中,转染48小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用WesternBlot技术检测发现我们构建的敲除质粒si-RCAN1可以有效的降低RCAN1在细胞中的表达。2. RCAN1通过提高胞质内IκBα的蛋白水平来降低NF-κB的转录活性：将pRCAN1.1-6myc和pRCAN1.4-6myc及对照质粒分别转染HEK293细胞,转染48小时收集细胞提取细胞总蛋白,用WesternBlot技术首先检测了质粒在细胞中的表达情况,结果显示质粒pRCAN1.1-6myc和pRCAN1.4-6myc在HEK293细胞中有较好的表达。用anti-IκBα抗体检测发现,细胞内高表达RCAN1.1和RCAN1.4可以明显的提高细胞内源性IκBα的蛋白水平。将质粒si-RCAN1及其对照质粒si-con分别转染到细胞HEK293中,48小时后,提取细胞蛋白,WesternBlot检测发现低表达RCAN1可以明显降低细胞内源性IκBα的蛋白质水平。3. RCAN1通过抑制IκBα-Y42位磷酸化来提高IκBα的蛋白质水平：将质粒si-RCAN1和pNF-κBluc/pRLTK共同转染到HEK293细胞中,然后分别加入Bay11-7085和Genistein, NF-κB的荧光素酶活性检测发现,酪氨酸酶抑制剂Genistein明显抑制NF-κB的转录活性,IKK抑制剂Bay11-7085对NF-κB的转录活性无影响。用200mM的双氧水处理转染后的细胞,WesternBlot检测发现与对照组相比,细胞内高表达RCAN1可以抑制H202引起的内源性IκBα的降解,尤其是在10min、20min、30min可以检测到IκBα蛋白水平的明显增高,而对照组IκBα的蛋白水平发生明显降低。而敲除RCAN1对H2O2引起的细胞内源性IκBα的降解与对照组有相似的趋势。将质粒IκBα-myc、 IκBα-Y42E-myc、 IκBα-Y42F-myc分别与pRCAN1.1mychis共转染到HEK293细胞中,48小时后,加入终浓度为200mM的H202刺激细胞,分别在0min、 10min、20min收取细胞,提取细胞的总蛋白,WesternBlot技术检测发现与对照组相比,细胞内高表达RCAN1对H2O2引起的IκBα-Y42E降解无作用；RCAN1抑制IκBα-Y42F降解的作用消失；但在野生型IκBα, RCAN1仍可抑制其降解。将质粒si-RCAN1及si-con分别转染到HEK293细胞中,免疫共沉淀法发现,敲除RCAN1可使IκBα-Y42磷酸化水平增加。将质粒pRCAN1.1-6myc、pRCAN1.4-6myc分别转染到HEK293细胞中,免疫共沉淀法发现,细胞内高表达RCAN1可以抑制IκBα-Y42的磷酸化。4. RCAN1抑制淋巴瘤细胞系Raji的细胞活性：用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1、 Ad-RCAN1.4以MOI为30感染淋巴瘤细胞系Raji,48小时后,荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光,感染效率达80%-100%,收取细胞,WesternBlot检测RCAN1在Raji中表达良好,并发现Ad-RCAN1感染细胞后细胞内源性IκBα的蛋白质水平明显增高,且Raji细胞的caspase3/7的水平也有所升高。用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1-1感染Raji细胞,用CCK8法检测发现过表达RCAN1明显抑制Raji细胞活性。而重组腺病毒对其他的淋巴瘤细胞系CA46、Daudi、Farage感染效率较低,且对细胞活力无明显作用。5. RCAN1抑制SCID鼠移植性淋巴瘤的生长：用重组腺病毒Ad-GFP、 Ad-RCAN1.1感染淋巴瘤细胞系Raji,建立SCID鼠移植性淋巴瘤模型。对小鼠成瘤的统计结果显示,RCAN1可以延迟小鼠成瘤时间,早期降低小鼠成瘤率,且RCAN1.1高表达组小鼠的肿瘤体积要明显的小于对照组,说明RCAN1可以抑制小鼠移植性淋巴瘤的生长。提取瘤组织总蛋白,Western Blot检测发现与对照组相比,RCAN1高表达组小鼠瘤组织中IκBα的蛋白质水平明显升高。6. RCAN1与IκBα蛋白-蛋白相互作用及RCAN1功能区域的确定：CO-IP实验结果发现RCAN1与内源性IκBα有相互作用,具体结果为用anti-myc做免疫沉淀,用anti-IκBα可以检测到与RCAN1相结合的IκBα;相反的用anti-IκBα抗体做免疫沉淀,然后用anti-myc (9E10)抗体做Western Blot检测,也可检测到与IκBα结合的RCAN1。IgG抗体做阴性对照。培养HEK293细胞,收集细胞后,用DCT3抗体(RCAN1-N末端抗体)做免疫沉淀,用anti-IκBα抗体做Western检测,进一步确定了内源性的RCAN1与内源性IκBα之间存在蛋白-蛋白相互作用。我们成功构建了RCAN1.1的截短片段的表达质粒,pRCAN1.1-103、pRCAN1-51-103 、pRCAN1-51-172 、pRCAN1-141-172、 pRCAN1-141-197。将这些质粒及pRCAN1.1-6myc分别转染HEK293细胞,48小时后,用anti-myc(9E10)做免疫沉淀,用anti-IκBα做WesternBlot检测,发现RCAN1与内源性IκBα相互作用的功能区域是N末端1-103aa,而其他片段与内源性的IκBα没有相互作用。7. RCAN1-1-103抑制NF-κB转录活性且RCAN1对NF-κB的影响不依赖于calcineurin:将质粒pRCAN1-1-103和pRCAN1.1-6myc分别同pNF-κBluc/pRLTK共转染到HEK293细胞中,转染48小时后,通过双荧光素酶基因报告系统检测发现RCAN1-1-103可以抑制NF-κB的启动子活性,其作用效果同RCAN1相似。用腺病毒Ad-RCAN1-1-103感染的Raji细胞,细胞活性明显受到抑制,即RCAN1-1-103可以抑制Raji勺细胞活性。将质粒pRCAN1-1-103.pRCAN1.1-6myc、si-RCAN1和calcineurin的表达质粒分别同pNFATluc/pRLTK共转染到HEK293细胞中,双荧光素酶基因报告系统检测发现与对照相比,RCAN1与calcineurin对NFAT的启动子活性作用相反,说明RCAN1对NFAT的作用是通过抑制calcineurin来抑制NFAT,而RCAN1.1-103对NFAT的启动活性无作用。将质粒pRCAN1.1-6myc. si-RCAN1和calcineurin的表达质粒分别同pNF-κBluc/pRLTK共同转染到HEK293细胞中,对NF-κB的启动子活性的检测发现RCAN1和calcineurin对NF-κB的作用趋势一样。以上结果证明了RCAN1引起的NF-κB启动子活性的降低不依赖于RCAN1对calcineurin的抑制作用。8.RCAN1.1及RCAN1-1-103蛋白质的分离纯化及蛋白活性的检测：我们成功的构建了含有RCAN1.1和RCAN1-1-103基因的原核生物表达载体,并将这些载体转化入BL21(DE3)感受态细胞中,保存了菌种。在蛋白质的分离纯化中,我们应用Ni-NAT亲和层析柱成功的获得了高浓度的RCAN1-1-103蛋白和TAT-RCAN1-1-103蛋白。但是并未得到纯化较好的RCAN1.1全长的蛋白质。在纯化蛋白的活性检查中,我们用纯化的RCAN1.1-103和TAT-RCAN1-1-103蛋白处理HEK293细胞,通过细胞免疫荧光染色发现,TAT-RCAN1-1-103蛋白可以成功的进入细胞,而RCAN1-1-103则不能通过细胞膜进入细胞。结论1.RCAN1可以抑制NF-κB的转录活性,降低NF-κB进入细胞核的水平,其胞质的蛋白水平相应的增加。2.RCAN1可以通过提高IκBα的蛋白水平,对NF-κB起到抑制作用。3.RCAN1通过抑制Y42的磷酸化抑制IκBα的降解,提高IκBα的蛋白质水平。4.RCAN1通过提高IκBα的蛋白水平,抑制NF-κB的转录活性,抑制淋巴瘤细胞系Raji的细胞活性。5. RCAN1可以通过提高肿瘤细胞Raji内IκBα的蛋白水平,抑制NF-κB的转录活性,从而降低SCID小鼠移植性淋巴瘤的肿瘤发病率,并抑制移植性淋巴瘤的生长。6. RCAN1与IκBα存在蛋白-蛋白相互作用,其作用区域为RCAN1 N末端的1-103个氨基酸。7. RCAN1对NF-κB的抑制作用不依赖与RCAN1对calcineurin的抑制作用。8.纯化的TAT-RCAN1.1-103蛋白可通过细胞膜进入细胞,起到一定的作用。意义综上所述,本课题研究证实了RCAN1对NF-κB的转录活性有抑制作用,这种调控是通过RCAN1和IκBα相结合,抑制IκBα-Y42的磷酸化提高IκBα的蛋白水平来实现的。而且我们证实RCAN1对淋巴瘤细胞系Raji有抑制作用,过表达RCAN1可以提高细胞内IκBα的蛋白水平,提高细胞Caspase3/7的水平,促进细胞凋亡。同时RCAN1能够抑制SCID小鼠移植性淋巴瘤的生长。RCAN1对NF-κB的抑制作用不同于RCAN1对NFAT的作用,前者主要的功能区域是N端的RCAN1-1-103,后者的RCAN1功能区域位于C端的140-197。我们的研究为临床淋巴瘤的治疗提供了新的方法思路,可以通过过表达RCAN1-1-103或者体内激活RCAN1来抑制肿瘤中持续活化的NF-κB.对小分子蛋白RCAN1-1-103的应用,既可以抑制淋巴瘤细胞的活性,又可以避免RCAN1广泛抑制Calcineurin引起的不良反应,在后续的实验中我们将进行深入研究。