背景缺血性疾病是由小动脉和毛细血管阻塞或狭窄引起的一系列疾病,且不能通过侧支循环或血管扩张得到代偿,是导致世界范围内致残和死亡的主要原因。血管形成由缺血性条件触发,是新血管形成和随后的血管网扩展的关键过程。因此,血管形成对缺血组织的生理恢复和功能保护具有重要意义。线粒体是大多数真核细胞中最主要的能量生产细胞器,并被广泛报道其通过调节内皮细胞的迁移、增殖和存活在血管形成中发挥关键作用。线粒体通常以动态的网络形式存在,并常改变其形状和亚细胞分布。线粒体动力学受两个相反生物过程的精确调控:融合和分裂。研究表明,增强的线粒体分裂在乳腺癌细胞的迁移和侵袭以及血管平滑肌细胞的迁移中发挥重要作用。但是,线粒体动力学和能量变化在血管形成中的作用尚不清楚。咖啡因作为咖啡、茶、碳酸饮料以及各种药物的组成成分,能够引起多种生理性和药理性作用。然而,咖啡因在血管形成中的作用报道较少。研究表明,咖啡因能够提高阿尔茨海默氏症小鼠及其细胞的线粒体功能,并通过线粒体依赖性过程提高内皮细胞的功能,提示咖啡因或许能够调节线粒体功能。但是,咖啡因能否通过调控线粒体动力学调节血管形成的机制仍未阐明。目的本课题旨在探讨咖啡因在血管形成过程中对内皮细胞行为的影响及其线粒体动力学和生物能机制。方法利用内皮细胞增殖、迁移、成管等体外实验确定咖啡因和血管形成的关系。利用酶联免疫吸附实验、蛋白质免疫沉淀、信号分子激动剂和抑制剂和RNA干扰技术验证c AMP/PKA/AMPK/MFF信号通路在咖啡因诱导的血管形成中的作用。利用Seahorse细胞能量代谢分析评价线粒体能量变化。利用8周龄C57BL/6雄性小鼠建立股动脉结扎下肢缺血模型,用以评价咖啡因与组织缺血后下肢血流恢复的联系。利用免疫荧光染色分析线粒体形态、内皮细胞伪足、缺血下肢腓肠肌毛细血管和小动脉密度。结果咖啡因在体外能够通过浓度依赖性提高内皮细胞的成管和迁移功能显著促进血管形成,而对细胞增殖无明显作用。咖啡因（50μM）通过激活c AMP/PKA/AMPK信号通路促进内皮迁移,该作用可被c AMP类似物8-Br-c AMP模拟,并被PKA抑制剂H89,腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或AMPK抑制剂复合物C阻断。此外,咖啡因（50μM）通过促进线粒体分裂蛋白Drp1磷酸化能够显著诱导线粒体分裂。使用Mdivi-1（10μM）药理性抑制Drp1或敲低Drp1干扰线粒体分裂能够显著抑制咖啡因诱导的板状伪足形成和内皮细胞迁移。从机制上讲,咖啡因诱导的线粒体分裂能够促进线粒体在板状伪足区域的聚集和该区域线粒体产能的增加,这两者均是细胞迁移所必需的。在小鼠下肢缺血模型中,咖啡因摄入能够显著促进缺血下肢的血管形成和血流灌注,以及内皮AMPK信号的激活。综上所述,咖啡因通过激活c AMP/PKA/AMPK/MFF信号通路介导线粒体分裂。而在咖啡因通过改变线粒体分布和能量合成诱导的内皮细胞迁移中,线粒体分裂发挥重要作用。结论1.低浓度咖啡因能够通过c AMP/PKA/AMPK/MFF信号通路诱导内皮细胞线粒体分裂。2.线粒体分裂增加能够增强线粒体的能量合成,并调控线粒体在内皮细胞边缘的重新分布,从而细胞促进板状伪足的形成。3.低浓度咖啡因通过线粒体分裂依赖性方式在内皮细胞中发挥促血管形成作用。4.在小鼠下肢缺血模型中,咖啡因处理能够促进缺血下肢的血管形成和血流灌注。