阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),俗称老年痴呆症,是一种较常见的神经退行性疾病,老年斑、神经纤维缠结、神经细胞凋亡是其三大病理学特征。越来越的证据表明：β-淀粉样肽(p-amyloid peptide, Aβ42)的大量产生和聚集是导致AD发生、发展的根本原因。大量的研究证明,Aβ42寡聚体是最具神经细胞毒性的形式。Aβ42在体内由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶顺次剪切产生的,即β-分泌酶剪切APP产生C99,γ-分泌酶再剪切C99产生Aβ42。本论文分别针对Aβ42寡聚体的细胞毒性和针对γ-分泌酶的催化组分PS1与C99相互作用两个重要环节对抗Aβ42的抗体和天然药物组分进行了研究。一、针对Aβ42寡聚体靶点的抗Aβ42抗体的效应分析一直以来困扰AD免疫治疗的主要问题是疫苗或抗体的安全性。在前期研究中,我们设计合成了多种Aβ42相关抗原蛋白,并获得了相应的抗Aβ42的系列抗体,其中抗原GST-I-Ap28和GST-Ap42诱导了最强的抗Aβ42的免疫反应,抗体滴度达到1：3200,这两种抗体在抑制和中和Aβ42细胞毒性方面也显示了最强的功效,并且透射电镜观察发现它们能够有效抑制、逆转Aβ42的纤维化。在本论文中：(1)分析了抗原GST-I-Ap28, GST-Ap42诱导的抗Aβ42抗体的亚型,结果发现：GST-I-Aβ28诱导的抗体主要为IgG1和IgG2b亚型,而GST-Aβ42诱导的抗体则主要为IgG2b和IgG2a亚型,这表明GST-I-Ap28主要诱导产生了Th2类免疫反应,而GST-Aβ42则主要诱导产生了Th1类免疫反应。上述结果表明了GST-I-Ap28作为免疫原的安全性。(2)分析了上述两种抗体对Aβ42不同聚集形式的识别特异性,结果显示：两者对Aβ42单体和Aβ42寡聚体的识别能力均高于对Aβ42原纤维和Aβ42纤维的识别。上述结果表明了GST-I-Ap28诱导抗体识别Aβ42寡聚体的有效性。(3)分析了上述两种抗体对转染了APP的靶细胞在Aβ42寡聚体基质上粘附的影响,结果显示：两种抗体均能有效抑制靶细胞在Aβ42基质上的粘附。最近有研究结果显示：Aβ42寡聚体可能是通过与细胞表面APP分子的相互作用,加速APP二聚化,导致APP的胞内区段被caspase 8水解产生具有潜在毒性的C31片段,引发神经细胞凋亡。上述结果显示：本论文分析的抗体可能是通过与Aβ42以及Aβ42的前体蛋白(如APP.C99)分子中的Aβ42区结合,从而阻碍了Aβ42与APP的相互作用,抑制了APP介导的Aβ42毒性通路。二、针对Aβ42寡聚体靶点的天然药物效应分析天然药物在AD治疗的研究中日益被重视。本论文选择了20种传统中药人参、枸杞、银杏、川芎、刺五加、五味子、母菊、丹参、蒲公英、丹皮、桃仁、红花、三七、生地、熟地、马齿苋、丹皮、赤芍、黄芪、远志、茯苓作为目标中药,提取了天然药物组分,针对Aβ42靶点,以PC12细胞为靶细胞,对这些天然药物的效应进行了分析：(1)通过MTT法检测这20种天然药物提取物对Aβ42细胞毒性的抑制和中和作用,结果发现：银杏、枸杞、母菊、远志等四种天然药物的提取物的作用显著。进一步研究确定了银杏黄酮、枸杞多糖、母菊内酯、母菊黄酮、远志皂甙等5种先导化合物为有效的天然药物成分,其中母菊内酯、母菊黄酮在抑制和中和Aβ42细胞毒性方面的作用最强。(2)通过透射电子显微镜观察发现：母菊内酯、母菊黄酮具有抑制、逆转Aβ纤维化的作用。(3)分析了母菊内酯、母菊黄酮对转染了APP的靶细胞在Aβ42寡聚体基质上粘附的影响,结果显示：两者均能有效抑制靶细胞在Aβ42基质上的粘附。(4)进一步通过细胞粘附实验分析了母菊黄酮、母菊内酯对转染了γ-分泌酶催化组分PS1及其N-、C-片段(PSl-F、PSl-N、PSl-C)的COS-7细胞在C99基质上的粘附的影响,并通过免疫共沉淀实验分析了母菊黄酮、母菊内酯对PS1和C99相互作用的影响。上述分析均以PS1的另一种重要底物NOTCH△E (Notch的β-分泌酶剪切产物)为对照。研究结果显示：母菊黄酮、母菊内酯抑制了转染了PS1的靶细胞COS-7在C99基质上的粘附,同时也抑制了PS1与C99的相互作用,但对PS1与NOTCH△E的相互作用无明显影响。综上所述,由于母菊黄酮、母菊内酯表现出的一系列与抗Aβ42抗体类似的功效,推测它们可能是通过与C99分子中的Aβ42区域特异性结合,从而特异性抑制PS1和C99的相互作用。上述结果表明母菊内酯、母菊黄酮在针对Aβ42寡聚体的细胞毒性和针对PS1与C99相互作用两个重要环节上均具有显著的功效。本论文的研究结果为防治AD的抗体或天然药物的应用研究和药物制备提供了理论指导。